通腑解毒法調(diào)節(jié)大鼠腦缺血/再灌注損傷后炎癥反應(yīng)及神經(jīng)保護(hù)機(jī)制

李云波

缺血再灌注損傷首先由Jennings于1960年提出, 腦缺血再灌注損傷是指缺血腦組織在恢復(fù)血液灌注后, 腦組織損傷進(jìn)一步加重［1］。大量研究表明, 腦缺血/再灌注損傷主要與炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、鈣離子超載等有關(guān)［2］。

大量研究表明：腦梗死急性期血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)濃度明顯增高。中醫(yī)對腦缺血的治療有不可替代的優(yōu)勢, 但作用機(jī)制不十分清晰, 本實(shí)驗(yàn)試圖從炎癥反應(yīng)機(jī)制來詮釋通腑解毒法對急性缺血性中風(fēng)可能的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制, 為揭示中醫(yī)藥促進(jìn)腦梗死恢復(fù)作用機(jī)制提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動物分組及模型建立 健康雄性（Sprague-Daw）大鼠 50 只 , SPF 級 , 體質(zhì)量 250～300g, 由廣東省衛(wèi)生廳實(shí)驗(yàn)動物中心提供。合格證號：0045633 。通腑醒神膠囊(非上市藥物, 廣東省中醫(yī)院制劑, 國家食品藥品監(jiān)督局批準(zhǔn)研究用)主要成分：番瀉葉、虎杖、人工牛黃、天竺黃、栝蔞仁等藥物組成。隨機(jī)分為三組 A假手術(shù)組(10只)、B模型對照組(20只)、C通腑醒神膠囊干預(yù)組(20只)。采用大腦中動脈(MCA)阻塞方法制備大鼠腦缺血/再灌注損傷模型。通腑醒神干預(yù)組與模型對照組均按上法造模?？p合切口。立即灌胃給藥：通腑醒神干預(yù)組：配成1g/ml藥物溶液, 0.2ml/100g灌胃；假手術(shù)組同模型對照組給予相同量0.9%生理鹽水。

1. 2 指標(biāo)觀察與評價(jià) 動物行為學(xué)變化和神經(jīng)缺損功能測定:在造模術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后2 h、術(shù)后24 h、術(shù)后 72 h、術(shù)后1 w)按下列兩種方法進(jìn)行行為檢測。LongaEZ［3］的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)。

1. 3 動物處理及取材 兩周后, 大鼠腹腔注射10%水合氯醛(3.5 m l/kg)麻醉, 斷頭取腦, 置于標(biāo)本瓶-20℃保存。樣品處理：取右腦組織倒入玻璃勻漿器中, 再加人冷凍的PBS, 按腦組織重量與勻漿總體積1：10的比例, 稀釋混勻。將制備好的 10%腦勻漿以 3000 r·min-1離心 15 min, 取上清置 -20℃保存待測。

1. 4 酶聯(lián)免疫吸附法測定腦勻漿上清TNF-α 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(武漢中美科技有限公司 0133R)實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1. 5 腦梗死體積 72 h后假手術(shù)組隨機(jī)取3只, 治療組、模型組隨機(jī)各取7只。將腦片浸入37℃的2%四氮唑紅(TTC)染色10 min。正常組織染成深紅色, 梗死灶呈白色。根據(jù)蒼白區(qū)觀察梗死灶范圍。先用掃描儀將圖像掃入LU ZEΧ2F 型圖像分析儀分析測量腦梗死面積, 再按梯形法則計(jì)算腦梗死灶體積。

1. 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示, 組間比較采用t檢驗(yàn)/方差分析；方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)(Keuskal-Wallis法等)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。（P＜0.05）表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果

2. 1 各組神經(jīng)功能缺損程度評分結(jié)果(表1) 腦梗死術(shù)后相同時(shí)間點(diǎn)比較 , 除術(shù)后 2 h 外 , 通腑組大鼠 LongaEZ 5 分制評分均低于模型組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組動物L(fēng)ongaEZ 5分制評分結(jié)果(±s)

表1 各組動物L(fēng)ongaEZ 5分制評分結(jié)果(±s)

注 ：△與模型組比較 , P＜0.01 ； ( )內(nèi)為動物數(shù) , 單位 :只

組別 術(shù)后2h 術(shù)后24 h 術(shù)后72 h 術(shù)后1 w TF組N.S.組1.74±0.45(19)1.85±0.45(18)2.18±0.50(19△)2.63±0.49(18)1.83±0.65(18)△2.35±0.49(16)1.31±0.47(9)△2.00±0.57(7)

2. 2 酶聯(lián)免疫吸附法測定腦勻漿上清TNF-α 各組大鼠大腦皮層TNF-α檢測結(jié)果(表2)。

表2 各組鼠腦勻漿中TNF-α水平(±s)

表2 各組鼠腦勻漿中TNF-α水平(±s)

注：TF 組：通腑干預(yù)組 , N.S.組：模型對照組 , Sham 組：假手術(shù)組。與 Sham 組比較 , *P＜0.05, **P＜0.05。

組別 C濃度(pg/ml)TF組(給通腑醒神組) 12575.64±3287.819*N.S.組(給生理鹽水) 14290.03±4689.27**Sham組(給生理鹽水) 7695.033±1481.749

各組腦組織中TNF-α濃度結(jié)果表明：大鼠腦組織損傷2w, 通腑組及模型組腦組織TNF-α表達(dá)仍高于假手術(shù)組, 具有顯著性差異(P＜0.01)；但通腑組及模型組相比無明顯差異(P＞0.05)。

2. 3 腦梗死情況(表3)

表3 兩組大鼠腦梗死灶體積比較(mn3，±s)

表3 兩組大鼠腦梗死灶體積比較(mn3，±s)

注 ：*與對照組比較 P＜ 0.01。

組別 n 組別鼠數(shù)腦梗死灶體積(mm3)TF組N.S.組77 134. 40±45. 257*192. 11±19. 53

TTC染色結(jié)果表明, 假手術(shù)組腦片均紅染, 無白色梗死灶形成。再灌注72 h時(shí), 通腑醒神干預(yù)組與模型對照組均有不同程度的白色梗死灶, 主要位于額頂部外側(cè)皮質(zhì)及紋狀體。術(shù)后72 h通腑組的腦梗死體積明顯低于模型組, 兩組相比具有明顯差異(P＜0.01)。

3 討論

腦缺血后的炎癥反應(yīng)一是以腦微血管內(nèi)白細(xì)胞聚集穿過血管壁, 浸潤腦組織, 伴有微血管功能紊亂及局部腦組織中液體及蛋白質(zhì)積聚為標(biāo)志的急性炎癥過程；二是曾有研究證明腦缺血再灌注24h時(shí)血腦屏障被破壞最嚴(yán)重［4,5］因此抑制炎癥因子的表達(dá)可作為防止腦缺血性疾病的新途徑。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 假手術(shù)組腦切片與模型對照組腦切片對比顯示, 腦缺血再灌注損傷72 h后大鼠右腦出現(xiàn)大面積腦梗死現(xiàn)象；通腑醒神膠囊干預(yù)組腦切片與模型對照組腦切片對比顯示, 通腑解毒法可以使MCAO模型SD大鼠腦缺血/再灌注損傷 72 h 腦梗死體積顯著減?。唤档驮炷：?24 h、72 h、1 w, 3個時(shí)間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能缺損評分, 對缺血性神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

TNF-α是一種由細(xì)胞分泌的前炎性細(xì)胞因子, 參與機(jī)體的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。TNF-a是腦缺血損傷后最早出現(xiàn)的炎性細(xì)胞因子之一［6］。腦缺血/再灌注損傷2w時(shí),腦組織中TNF-α表達(dá)仍高于正常, 提示腦缺血/再灌注損傷后炎癥反應(yīng)持續(xù)存在；提示中的TNF-α在腦缺血損傷作用表現(xiàn)為損傷和抗損傷的雙重作用, 因此, 我們推測, 通腑解毒法對缺血性中風(fēng)急性期腦損傷的治療作用可能是通過抑制TNF-α等多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、釋放,從而減輕或中斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)、減少細(xì)胞凋亡達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的目的, 從而對腦損傷起到治療作用。為推廣通腑解毒法在中風(fēng)急性期的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通腑解毒法可以明顯改善腦缺血/再灌注損傷后炎癥反應(yīng), 但有關(guān)TNF-α在腦缺血中保護(hù)與損傷作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究與探討。

［1］ 徐海清.腦缺血病灶炎癥反應(yīng)的意義.國外醫(yī)學(xué)神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊 , 2002, 29(5):430-432.

［2］ 劉建輝, 冀鳳云, 王婷, 等.三七總皂苷對腦缺血再灌注損傷腦保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.中國臨床神經(jīng)科學(xué), 2002, 10(1):90.

［3］ 杜力軍, 周金黃, 邢東明.從中藥新藥研究對證動物模型的思考 .中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)雜志 , 2000, 10(1):23-26.

［4］ 張勇, 楊利生, 李緩.通腑法治療出血性中風(fēng)探討.陜西中醫(yī),2005；26(2):140.

［5］ 陳苡靖.化痰通腑法治療中風(fēng)病急性期探討.遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) , 2004, 6(6)44l-442.

［6］ O'Hara0, Yonekawa Y, Tanaka k, et a1.The role of brain— derived neurotrophlc factor in transient forebrain ischemia in rat brain.Neurosurgery， 1994,34:323.