臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在遺傳性痙攣性截癱中的應(yīng)用

劉靜 韓冬梅 王志東 鄭曉麗 丁麗 朱玲 薛梅 閻洪敏 郭子寬 王恒湘

遺傳性痙攣性截癱（HSP）是一組以對稱性雙下肢進(jìn)行性肌無力和肌張力增高為主要表現(xiàn)的遺傳性神經(jīng)變性疾病。病情進(jìn)行性進(jìn)展，最后喪失自主生活能力，既往缺乏有效治療措施，預(yù)后差。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSC）來源于臍帶，易于獲取，體外能夠大量擴(kuò)增，低免疫原性，具有橫向分化的潛能，在適當(dāng)?shù)臈l件下可向外胚層的神經(jīng)細(xì)胞分化。我們采用UC-MSC鞘內(nèi)注射治療一家系父子2人HSP復(fù)雜型，取得一定療效，現(xiàn)報道如下。

1 病例資料

1.1 患者資料

子，17歲，為先證者。于2006年開始出現(xiàn)行走不穩(wěn)、四肢僵硬，雙手姿勢異常伴活動不利，言語不清楚，癥狀逐漸加重。2010年2月，顱腦MRI示小腦輕度萎縮；肌電圖檢查示左側(cè)正中、尺神經(jīng)運(yùn)動神經(jīng)M波潛伏期稍延長，下波100%，sev正常，左側(cè)大小魚際肌、胸鎖乳突肌、雙側(cè)脛前肌及胸10～11脊旁肌未見自發(fā)電位，MUAP稍寬大；X線提示雙手無明顯骨關(guān)節(jié)病變；查銅蘭蛋白正常。經(jīng)北京市神經(jīng)肌肉病協(xié)會會診中心會診（編號1938），診斷為HSP復(fù)雜型。2009年9月來我院就診，入院查體：意識清楚，語言不清、欠流利。四肢肌力正常，四肢肌張力明顯升高，雙手尤著，致手指運(yùn)動受限，雙手拇指及食指外展明顯受限。痙攣性剪刀步態(tài)，行走不穩(wěn)，易摔跤，步速減慢，不能走直線，不能跑跳，不能單腿站立，自然站立時足距明顯增大（25～35 cm），閉目難立征陽性（睜、閉眼明顯晃動）。雙側(cè)指鼻試驗、指指試驗、輪替試驗、跟膝脛試驗正常。雙眼凝視時有短暫眼震，眼球追蹤檢查者手指時有輕度跳躍，雙眼掃視無辨距不良。肱二頭肌腱反射（++），肱三頭肌腱反射（++），橈骨膜反射（++），膝腱反射（++++），跟腱反射（++++）。 臏、踝陣攣(+)。 診斷：HSP（復(fù)雜型）。

父，40歲，于2000年開始出現(xiàn)四肢僵硬，走路、站立不穩(wěn)，言語不清楚，呈進(jìn)行性加重，偶有飲水嗆咳。頭顱MRI顯示小腦萎縮。2009年9月來我院，入院查體：意識清楚，口齒略不清、欠流利，四肢肌力正常，四肢肌張力明顯升高，雙下肢尤著。行走呈剪刀步態(tài)，行走搖晃、緩慢，轉(zhuǎn)身困難，不能走直線，不能跑跳，不能單腿站立，自然站立時足距輕度增大（10～25 cm），閉目難立征陽性（睜、閉眼立即摔倒）。雙側(cè)指鼻試驗、指指試驗欠穩(wěn)準(zhǔn)，無意向性震顫，雙側(cè)輪替試驗、跟膝脛試驗正常。雙眼凝視時有短暫眼震，眼球追蹤檢查者手指時有輕度跳躍，雙眼掃視無辨距不良。雙側(cè)肱二頭肌腱反射（++），肱三頭肌腱反射（++），橈骨膜反射（++），膝腱反射（++++），跟腱反射（++++），臏陣攣（-），踝陣攣（+）。 具有家族遺傳病史。 診斷：HSP（復(fù)雜型）。

告知患者治療風(fēng)險，簽署知情同意書，治療方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。兩患者均具有干細(xì)胞治療適應(yīng)證：無發(fā)熱、感染，無凝血功能及心、肺、肝、腎等重要臟器功能障礙。

1.2 家系調(diào)查

該家系4代共有5人發(fā)病，本報道中子系第4代患者，為先證者（圖1）。

圖1 遺傳性痙攣性截癱家系圖譜（→：先證者）Fig.1 Pedigree of a family with HSP(allow:propositus)

2 方法

2.1 UC-MSC的制備

[1]方法，稍加改良后進(jìn)行UC-MSC制備。即，經(jīng)知情同意及感染源檢測后收集臍帶，去除外膜和動靜脈，將臍帶剪成0.5 cm3大小的組織塊，加入等體積0.2%Ⅰ型膠原酶，37℃消化過夜。次日加入2倍體積的0.05%的胰蛋白酶，37℃消化1 h。2 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，計活細(xì)胞數(shù)。將細(xì)胞懸浮于hMSC無血清培養(yǎng)基中，按106cells/cm2底面積接種于塑料培養(yǎng)瓶中。1周后出現(xiàn)由數(shù)十個形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞組成的集落。加入0.05%胰蛋白酶消化，并按6 000 cells/cm2底面積進(jìn)行傳代培養(yǎng)。利用流式細(xì)胞測定細(xì)胞表型，常規(guī)感染源檢測后，收集細(xì)胞用于治療?；蚴斋@細(xì)胞置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆茫们霸?7℃環(huán)境下快速復(fù)蘇，24～48 h培養(yǎng)，收獲貼壁生長的細(xì)胞供臨床應(yīng)用。

2.2 UC-MSC注射

入院第3或第4天開始給患者行腰椎穿刺，鞘內(nèi)注射UC-MSC，1次/周，4次為1個療程。常規(guī)腰穿，將 UC-MSC 10 mL（每次 1×106cells/kg）+地塞米松5 mg在10 min內(nèi)緩慢注入蛛網(wǎng)膜下腔，拔針，敷以無菌輔料，囑患者去枕平臥6 h。兩患者于2009年9月接受第1療程治療，于2010年4月接受第2療程治療。

2.3 輔助治療

進(jìn)行常規(guī)系統(tǒng)康復(fù)鍛煉。

2.4 評估標(biāo)準(zhǔn)

采用改良Ashworth肌張力分級標(biāo)準(zhǔn) （MAS）[2]、世界神經(jīng)病聯(lián)合會國際合作共濟(jì)失調(diào)評分量表（ICARS）[3]及日常生活量表（ADL），對患者治療前及治療后1個月的神經(jīng)功能及生活質(zhì)量進(jìn)行評定，MAS（分 0、1、1+、2、3、4 級，0 級為正常）越高、ICARS及ADL分值越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

2.5 不良反應(yīng)及并發(fā)癥觀察

觀察治療中及治療后有無發(fā)熱、腰痛、頭痛、頭暈等不良反應(yīng)。

3 結(jié)果

末次治療結(jié)束后隨訪20個月，每個月對患者進(jìn)行1次隨訪。

子在第一療程治療后，言語流利程度較前改善，四肢肌張力明顯降低，行走站立穩(wěn)定性提高，自然站立時足距輕度增大（10～25 cm），步速加快，可跑跳，可以走線行走，可單腿站立（10～20 sec），閉目難立征陽性（睜眼正常，閉眼輕度晃動）。余無明顯變化。第二療程治療前發(fā)現(xiàn)，患者足距正常（<10 cm），雙眼凝視時短暫眼震消失。第二療程治療后，雙手肌張力較前進(jìn)一步下降，雙手拇指及食指外展仍輕度受限。雙臂肌張力恢復(fù)正常，雙下肢肌張力接近正常，行走接近正常，速度加快，可跑跳，可以走直線，可單腿站立（10～20 sec），可雙足并立下蹲站起。閉目難立征陽性（睜眼正常，閉眼輕度晃動）。雙眼凝視時無眼震，眼球追蹤檢查者手指時無跳躍。余無明顯變化。治療后ICARS評分、ADL評分、改良的Ashworth肌張力分級均降低（表 1、2）。

父在第一療程治療后飲水嗆咳消失，言語較前流利，四肢肌張力下降，行走、站立穩(wěn)定，行走搖晃減輕，轉(zhuǎn)身仍困難，閉目難立征陽性（睜眼輕度晃動，閉眼明顯晃動）。右手指鼻穩(wěn)準(zhǔn)，左手指鼻略有偏差，余無明顯變化。第二療程治療前發(fā)現(xiàn)，患者行走穩(wěn)定性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)身自如，但雙手指鼻欠穩(wěn)準(zhǔn)，雙眼凝視時有持續(xù)眼震，雙眼掃視時存在辨距不良。第二療程治療后，雙手指鼻試驗恢復(fù)正常，余無明顯變化。治療后ICARS評分、ADL評分、改良的Ashworth肌張力分級均降低（表 1、2）。

父子2人每次治療后均無任何不良反應(yīng)，分別在第二療程治療后7個月及8個月內(nèi)病情穩(wěn)定，隨后癥狀均逐漸加重。

表1 患者治療前后ICARS及ADL評分Table 1 ICARS and ADL score before and after the treatment

表2 患者治療前后改良的Ashworth肌張力分級的變化Table 2 Modified Ashworth Scale before and after the treatment

4 討論

遺傳性痙攣性截癱（HSP）是一種罕見的遺傳性脊髓小腦變性病。主要由于皮質(zhì)脊髓束和脊髓小腦束軸索變性和脫髓鞘所引起，脊髓前角、基底節(jié)、小腦、腦干、視神經(jīng)也可受累。HSP發(fā)生率低，國外發(fā)病率為0.096‰，國內(nèi)尚無其流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果。HSP有3種遺傳方式，為常染色體顯性遺傳（AD-HSP）、常染色體隱性遺傳 （AR-HSP）和X連鎖隱性遺傳（X-linked HSP），這些遺傳方式中，AD-HSP約占70%[4]。根據(jù)臨床表現(xiàn)，HSP可分為單純型和復(fù)雜型。該家系有明確的家族遺傳史，連續(xù)4代發(fā)病，男女皆有，父子倆表現(xiàn)為肌張力增高、腱反射亢進(jìn)、病理反射陽性、構(gòu)音障礙、眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)，兒子發(fā)病較其父提前。根據(jù)家系圖譜遺傳特點和臨床表現(xiàn)，考慮該家系為復(fù)雜型HSP，為常染色體顯性遺傳。該病至今無特效藥物治療。由于疾病進(jìn)行性進(jìn)展，最終患者將喪失自主生活能力，給患者及家庭造成沉重的負(fù)擔(dān)。而間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）在修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和疾病方面具有潛在作用，為遺傳性神經(jīng)變性疾病的治療帶來希望。

人臍帶華爾通膠含有豐富的MSC。MSC在體外能夠大量擴(kuò)增，還可凍存、復(fù)蘇，短期內(nèi)即可獲得足量細(xì)胞用于臨床治療。UC-MSC不表達(dá)與移植排斥相關(guān)的HLA-DR，在混合淋巴細(xì)胞檢測中呈免疫抑制，并抑制T細(xì)胞增殖，異體移植該細(xì)胞可產(chǎn)生免疫耐受性[5]，表明其為一類免疫缺陷細(xì)胞，異基因移植不會發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。

動物實驗已證明，MSC具有促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的作用。將人UC-MSC移植至帕金森模型大鼠和正常大鼠，無排斥反應(yīng)，無腫瘤產(chǎn)生及其他不良反應(yīng)。治療后的第6周，尤其第12周，帕金森模型大鼠臨床癥狀得到明顯改善。其作用機(jī)理可能與人UC-MSC分泌多種多巴胺神經(jīng)元營養(yǎng)因子和成纖維細(xì)胞生長因子有關(guān)，抑或與人UC-MSC具有的免疫抑制作用有關(guān)，使得受損的神經(jīng)元恢復(fù)功能[6]。移植人UC-MSC可明顯改善共濟(jì)失調(diào)小鼠運(yùn)動功能，減輕小腦萎縮，植入的UC-MSC可在小腦中停留至少3個月而無明顯分化，其作用機(jī)制可能與其提高某些神經(jīng)營養(yǎng)因子如胰島素樣生長因子-1（IGF-1）及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）在小腦中的表達(dá)有關(guān)[7]。移植人UC-MSC可有效改善中風(fēng)模型大鼠的神經(jīng)功能。人UC-MSC有向大腦缺血區(qū)遷移的能力，在損傷區(qū)域向膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，促進(jìn)損傷部位神經(jīng)及血管形成，進(jìn)而改善缺血區(qū)的血流。人UC-MSC分泌的各種神經(jīng)營養(yǎng)因子在神經(jīng)損傷修復(fù)中起到重要作用[8-9]。在臨床試驗中，Lee等將自體骨髓MSC通過靜脈或動脈輸注治療11例多系統(tǒng)萎縮（MSA）患者，經(jīng)過12個月的觀察研究，發(fā)現(xiàn)癥狀得到明顯改善，UMSARA評分有顯著差異。認(rèn)為自體骨髓MSC治療是安全的，在一定時期內(nèi)延遲了疾病的進(jìn)展[10]。我中心采用UC-MSC鞘內(nèi)注射治療22例脊髓損傷（SCI）患者，13例有效，9例無效。不完全性SCI患者有效率達(dá)81.25%，完全性SCI的6例患者均無效。有5例有效的患者接受了2或3個療程治療，療效均有進(jìn)一步的提高。且有效患者療效持久[11]。我中心采用UC-MSC鞘內(nèi)注射治療脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（SCA）與多系統(tǒng)萎縮小腦型（MSA-C）24例患者中23例有效，其中3例接受第二療程治療后獲得了進(jìn)一步療效，41.61%的患者隨訪半年以上疾病仍在穩(wěn)定狀態(tài)，而58.33%的患者在治療后1～14個月（平均3個月）疾病進(jìn)行性發(fā)展[13-14]。本報道中父子2人經(jīng)過UC-MSC鞘內(nèi)注射治療1個療程后四肢肌張力降低、行走站立穩(wěn)定性增加、言語較前流利，經(jīng)第二療程治療后病情有進(jìn)一步改善，但隨訪觀察發(fā)現(xiàn)療效不能持久保持。

目前認(rèn)為，MSC治療神經(jīng)變性疾病的機(jī)制，可能與MSC介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)，通過分泌的多種神經(jīng)營養(yǎng)因子 （NTF），如腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、β 神經(jīng)生長因子 （β-NGF）、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）等，支持神經(jīng)細(xì)胞生存，誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞再生，促進(jìn)神經(jīng)纖維在損傷部位再生；而神經(jīng)炎性機(jī)制在神經(jīng)變性疾病發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，通過細(xì)胞間的接觸、免疫抑制相關(guān)的多種細(xì)胞因子的分泌，抑制T淋巴細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，從而達(dá)到治療作用[8-9，14-16]。

在安全性方面，我中心采用UC-MSC鞘內(nèi)注射治療22例SCI患者，治療后1例出現(xiàn)頭痛，1例出現(xiàn)腰痛，均在1～3 d內(nèi)消失，隨訪3個月～3年，無治療相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生[10]。我中心采用UC-MSC鞘內(nèi)注射治療24例SCA與MSA-C患者，治療后2例出現(xiàn)頭暈，2例出現(xiàn)腰痛，2例出現(xiàn)頭痛，均在1～3 d內(nèi)消失[12]。本報道中的2例患者經(jīng)4個療程治療后，均未見任何不良反應(yīng)發(fā)生，表明UC-MSC鞘內(nèi)注射治療是安全的。

對于神經(jīng)變性疾病，由于病因無法根除，UCMSC療效僅能維持一定時間，隨著移植細(xì)胞的凋亡，療效將會終止，疾病仍會進(jìn)展。父子2人各通過2個療程治療后，神經(jīng)功能得到改善，但分別在15個月及16個月后出現(xiàn)疾病進(jìn)行性進(jìn)展。因此，間斷給予UC-MSC治療可能是維持療效的一種方法。本報道病例數(shù)量少，治療安全性、療效、治療機(jī)制等需要大量病例的長期研究。

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