復(fù)方妥曲珠利緩釋微囊的藥效試驗(yàn)

高榮琨，錢銳，趙昕，鄭明學(xué)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801）

雞球蟲?。╟occidiosis）是由頂復(fù)器門艾美耳屬的幾種細(xì)胞內(nèi)寄生性原蟲引起的雞疫病的總稱［1］，由艾美耳球蟲中的一種或幾種寄生于雞腸道黏膜上皮引起的一種寄生性原蟲?。?］，是造成現(xiàn)代養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最大的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，球蟲病每年給全世界養(yǎng)雞業(yè)造成80億美元的經(jīng)濟(jì)損失。其中柔嫩艾美爾球蟲病最為嚴(yán)重，主要引起雞盲腸和附近區(qū)域組織的嚴(yán)重出血，雛雞排新鮮血便，之后盲腸排便完全停止，耐過的病雞長期不能康復(fù)，增重下降，生長發(fā)育嚴(yán)重受阻，成雞較少發(fā)病，但可成為帶蟲者，感染后其體質(zhì)和產(chǎn)卵能力均可受到影響［3，4］。

抗球蟲藥物是防治球蟲病的主要手段，盡管一些抗球蟲藥的使用促進(jìn)了養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，但長期使用也暴露了它的缺點(diǎn)［5］。首先，長期使用同一種藥物或者長期使用低濃度的抗球蟲藥物，很容易促使耐藥球蟲株的出現(xiàn)。其次，藥物對(duì)免疫的影響和殘留也是目前存在的問題。再次，抗球蟲藥主要是通過殺滅或抑制球蟲的繁殖來達(dá)到抗球蟲目的，它們只能對(duì)球蟲發(fā)育的早期或中期（無性繁殖期）起作用，而對(duì)出現(xiàn)血便后球蟲的有性繁殖期及抗損傷作用甚微或無作用。生產(chǎn)中一般發(fā)現(xiàn)血便，才知道雞患了球蟲病，但此時(shí)，球蟲已處于發(fā)育的有性繁殖期，抗球蟲藥收效甚微，因而雞球蟲病死亡率居高不下，給養(yǎng)雞業(yè)造成慘重?fù)p失。

由于藥物在球蟲病防治中具有重要的地位，且新藥相對(duì)老藥對(duì)球蟲較為敏感，抗球蟲指數(shù)高，短期內(nèi)不易產(chǎn)生耐藥性，所以需要新的、高效的抗球蟲藥物出現(xiàn)，以滿足市場(chǎng)的需求。為此，課題組［6］研制了具有抗球蟲和抗損傷作用的高效復(fù)方抗球蟲藥——復(fù)方妥曲珠利緩釋微囊（磺胺對(duì)甲氧嘧啶、甲氧芐啶、妥曲珠利、硝苯地、維生素E等），并對(duì)其最佳劑量進(jìn)行了選擇。為了延長該復(fù)方藥在腸道（盲腸）的存留和作用時(shí)間，保持有效藥物濃度，提高藥效，減少給藥次數(shù)和便于飲水給藥，本試驗(yàn)通過對(duì)復(fù)方妥曲珠利緩釋微囊對(duì)雞球蟲病的治療效果及給藥頻率的研究，為臨床合理應(yīng)用該藥提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)蟲株

柔嫩艾美耳球蟲強(qiáng)毒株（Etsx01，2010004），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

1日齡海蘭白小公雛，購自山西省太谷縣第一種雞場(chǎng)，在無球蟲環(huán)境中飼養(yǎng)，飼料經(jīng)高壓滅菌后使用，飲水為清潔涼開水，試驗(yàn)前7天經(jīng)糞便檢查，確認(rèn)無球蟲感染后作為試驗(yàn)用雞。

1.3 主要藥品與試劑

復(fù)方妥曲珠利緩釋微囊（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)病理實(shí)驗(yàn)室，批號(hào)：091105）；B型明膠（化學(xué)純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20081016）；戊二醛（分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20060715）；無水硫酸鈉（分析純 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，批號(hào)：091010）；氫氧化鈉（分析純天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20070301）；羧甲基纖維素鈉（CMC，安徽山河藥用輔料有限公司，批號(hào)：080503）；卡波姆（北京國人逸康科技有限公式，批號(hào)：20080120）；聚乙二醇－6000（遼陽華興藥用輔料廠，批號(hào)：20080105005）；d－葡萄糖（北京化工廠，批號(hào)：750516）。

1.4 儀器及耗材

KS225A 電子分析天平（Swiss made）；76－1恒溫玻璃水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；

KQ－500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；101－3－S－II型恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；光學(xué)顯微鏡（LEICA BME）；LXJIIB型大容量低速離心機(jī)（飛鴿）；SHZ－D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠）；ZHWY－103B型恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器制造有限公司）；681型磁力加熱攪拌器（中國上海南匯電訊器材廠制）；MM－2270MG型微波爐（青島海爾微波制品有限公司）。

1.5 實(shí)驗(yàn)前預(yù)處理

1.5.1 清潔與消毒

使用前先移出動(dòng)物房內(nèi)所有可移動(dòng)設(shè)備與裝置，然后徹底清洗，動(dòng)物房干燥后，用汽油噴燈火焰消毒雞籠和墻壁、地面上的雞毛與糞便殘?jiān)?/p>

地面、地面以上2米的墻壁及其它所有突出墻外的附屬設(shè)施進(jìn)行氨水噴霧消毒，然后密閉門窗，進(jìn)行熏蒸消毒（每立方米雞舍需用甲醛24mL、高錳酸鉀12g、水24mL）24～48h，用前通風(fēng)24～48h待用。

1.5.2 電線、塑料布、水槽、料槽

－20℃反復(fù)凍融3次（凍時(shí)將其放入塑料袋中不封口，將上述物品完全凍硬后取出。融時(shí)系住塑料袋口，放于室溫即可）達(dá)到無球蟲條件。

2 試驗(yàn)方法

2.1 復(fù)方妥曲珠利緩釋微囊藥效試驗(yàn)

2.1.1 實(shí)驗(yàn)分組

選擇12日齡健康小雛雞，逐只編號(hào)并空腹稱重，淘汰體重過小及過大雛雞，根據(jù)體重離散度隨機(jī)分為6組（設(shè)感染不給藥對(duì)照組T0和不感染不給藥對(duì)照組C0），每組15只，其中每大組平均分為3個(gè)小平行組。T0～T4組分組后次日每只雞人工感染柔嫩艾美爾球蟲（E.tenella）孢子化卵囊5.0×104個(gè)。感染用藥T1～T4組于感染后72h通過飲水將藥物按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法分別給藥至試驗(yàn)結(jié)束，詳見表1。

試驗(yàn)期間每天觀察雞群精神狀態(tài)、采食、血便、發(fā)病和死亡情況，并對(duì)第6d的血便進(jìn)行記分，同時(shí)收集第6、7d的糞便，用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行每克糞便卵囊記數(shù)（OPG）。感染后第8d稱重，剖殺，觀察盲腸病變并記分，記錄攻毒前體重、剖殺前體重、死亡率、盲腸病變記分，計(jì)算體增重、相對(duì)增重率和抗球蟲指數(shù)（ACI）。對(duì)于試驗(yàn)過程中死亡的雞及時(shí)剖檢，判定是否死于球蟲病。

表1 試驗(yàn)分組Table 1 Test Groups

2.1.2 試驗(yàn)考察指標(biāo)［7～9］

2.1.2.1 血便記分

在試驗(yàn)感染中，血便情況可用于對(duì)球蟲感染程度的判斷。自感染卵囊后每日觀察各組雞糞便情況，及時(shí)記錄血便出現(xiàn)時(shí)間和血便最嚴(yán)重時(shí)的血便百分率，進(jìn)行血便記分：

0分，100%的糞便不帶血；1分，不足25%的糞便帶血；2分，25%～50%的糞便帶血；3分，51%～75%的糞便帶血；4分，76%～100%的糞便帶血。

2.1.2.2 存活率及增重情況

存活率／%＝組內(nèi)存活雞數(shù)／組內(nèi)總雞數(shù)×100

平均增重＝（末重－初重）／雞數(shù)

增重率／%＝（末重－初重）／初重

相對(duì)增重率／%＝感染組雞平均增重／健康對(duì)照組雞平均增重×100。

2.1.2.3 OPG

OPG是指1g糞便中卵囊數(shù)。稱取1g雞糞，溶于10mL自來水中制成10倍的稀釋液，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅?滴置血球記數(shù)板中，在顯微鏡下計(jì)算記數(shù)室四角4個(gè)大方格中球蟲卵囊總數(shù)，除以4求其平均數(shù)，乘104即為 OPG［8］。

當(dāng)OPG為0～0.1時(shí)卵囊值為0；當(dāng)OPG為0.11～1.0時(shí)卵囊值為1；當(dāng) OPG為1.1～1.9時(shí)卵囊值為10；當(dāng)OPG為2.0～5.9時(shí)卵囊值為20；當(dāng)OPG值為6.0～10.9時(shí)卵囊值為30；當(dāng)OPG大于11.0時(shí)卵囊值為40。

2.1.2.4 盲腸病變記分

在試驗(yàn)感染中，盲腸病變記分和糞便記分同樣可用于對(duì)球蟲感染程度的判斷。按Johnson和Reid等的5分制記分。病變按有無輕重分為0、1、2、3、4五個(gè)等級(jí)。

0：未見病變；1：盲腸壁有極少量散在出血斑，腸壁不增厚，內(nèi)容物正常；2：盲腸內(nèi)容物有少量血液，腸壁稍增厚，可見多處出血斑；3：盲腸內(nèi)容物有多量血液或有盲腸芯，腸壁肥厚，盲腸萎縮，內(nèi)容物少；4：盲腸因充滿血液或盲腸芯而腫大，盲腸壁極度肥厚，病變達(dá)直腸部（若兩側(cè)病變不一致，以病變嚴(yán)重的一側(cè)為準(zhǔn)）。因球蟲病死亡雞只記4分。

病變值＝每組雞的平均病變記分×10

2.1.2.5 抗球蟲指數(shù)（ACI）

ACI按默克公司（Merck）的方法計(jì)算

ACI＝（相對(duì)增重率＋存活率）×100－（病變值＋卵囊值）。

ACI＜120為無效，ACI＝120～160為中等有效，ACI＝160～180為藥效良好，ACI＞180為高效。

2.2 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果中數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA方差分析，分析組間數(shù)據(jù)的差異顯著性。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 試驗(yàn)雞的臨床癥狀

T0～T4組雛雞經(jīng)口感染球蟲后第三天，精神沉郁，羽毛蓬亂，縮頭閉目，病雞呆立于雞舍一角，呈昏睡狀態(tài)，反應(yīng)遲鈍，食欲減退，糞便變稀。T1～T4組開始給予相應(yīng)藥物。第四天末開始，T0～T4組雛雞均排泄鮮血便，其中T0組血便嚴(yán)重，且陸續(xù)出現(xiàn)雞只死亡，分別于17日齡、18日齡各死亡3只；T1～T4組血便較少，雛雞均無死亡。詳見表2。

表2 雛雞攻毒后臨床表現(xiàn)Table 2 Clinical Manifestation after Chicks Challenge

剖檢死亡雞只見到雞冠與肉髯蒼白，盲腸腫大如拇指大小，內(nèi)有液狀或部分凝固的血液，黏膜面有大量出血點(diǎn)及出血斑，從漿膜面看非常明顯，外觀為暗紅色瘀點(diǎn)，其它組織器官無肉眼可見病變。

3.2 不同給藥次數(shù)對(duì)雞球蟲病治療效果的影響

T4、T1、T2和T3組的ACI依次增高，且均極顯著（P＜0.01）高于感染不給藥T0組，范圍為178.98～188.14，均達(dá)到良好抗球蟲效果；其中T2、T3組ACI＞180，達(dá)到高效抗球蟲作用。T1～T4組在試驗(yàn)?zāi)w重均有升高，相對(duì)增重率范圍為86.64%～92.36%之間，均比不感染對(duì)照C0組低，均極顯著（P＜0.01）高于T0組，其中T1～T3組組間差異不顯著；OPG均極顯著（P＜0.01）低于T0組，但各組之間差異不顯著（P＞0.05）；病變值均極顯著（P＜0.01）低于T0組，其中T1～T3組，病變值隨藥物首次給藥劑量增加而降低，詳見表3、圖1。

綜合上述結(jié)果，以ACI為考察重點(diǎn)，相對(duì)增重率和病變值為次要考察點(diǎn)，可以確定ACI最高、病變值最低且相對(duì)增重率適中的試驗(yàn)3組的首次給藥劑量和給藥頻率確定為復(fù)方妥曲珠利緩釋微囊的最佳給藥方案。

表3 各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果Table 3 Results the Indicators

圖1 各組相對(duì)增重率Fig.1 Relative weight gain rate of groups

4 分析與討論

4.1 復(fù)方妥曲珠利藥物作用機(jī)理

復(fù)方妥曲珠利藥物成分中，妥曲珠利是廣譜抗球蟲藥，高效低毒，可使球蟲細(xì)胞的所有發(fā)育階段都受到傷害，具有干擾核的分裂及線粒體的作用?；前奉愃幬镏饕种魄蛳x的生長繁殖，并無直接的殺蟲作用，作用機(jī)理是與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶，阻止二氫葉酸合成，最終影響蛋白質(zhì)的合成，實(shí)現(xiàn)抑制球蟲的目的?；前匪幾饔糜谇蛳x的第二代裂殖體，即球蟲生活史的第四天，甲氧芐啶也作用于球蟲無性繁殖的后期。鈣通道阻斷劑硝苯地平可以在柔嫩艾美耳球蟲病發(fā)生的早期阻斷球蟲的侵入，通過阻滯細(xì)胞膜上的鈣離子通道，抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，緩解宿主細(xì)胞的鈣超載［10～12］。Ve本身并沒有顯著的抗球蟲作用，但能增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高機(jī)體對(duì)各種應(yīng)激的耐受力，促進(jìn)病雞的康復(fù)，提高存活率和相對(duì)增重，從而顯著增強(qiáng)了雞對(duì)球蟲的抗性［13］。Ve是膜脂質(zhì)雙層中主要的抗氧化劑，是重要的氧自由基清除劑，可明顯降低血清脂質(zhì)過氧化物（包括 MDA）的濃度，具有中和清除能力［14］，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用。

治療時(shí)必須使用足夠的劑量和連續(xù)用藥才能有效，否則球蟲易產(chǎn)生抗藥性，并將這種耐藥性遺傳好幾代。如能合理配伍，本藥不但能夠抑制球蟲耐藥性，而且對(duì)混合細(xì)菌感染也有療效。

4.2 緩釋微囊的給藥方案

緩釋制劑以療效長［7］為其特點(diǎn)，復(fù)方妥曲珠利緩釋微囊是用天然粘附材料明膠制備的微囊，可與黏膜緊密接觸粘附在一起。雛雞的腸道粘膜是與腸內(nèi)容物直接接觸的部位，是腸道發(fā)揮消化吸收功能的界面，緩釋微囊經(jīng)口服混于食糜中達(dá)到腸道，明膠利用其生物粘附特性定位于腸道（盲腸），使藥物緩慢釋放，保持平穩(wěn)、長期而有效的治療濃度。

首次劑量過低時(shí)，藥效釋放緩慢，藥量不能達(dá)到其最低有效劑量，此時(shí)雛雞感染球蟲已有3天，蟲體大量繁殖，反復(fù)多次侵入盲腸上皮細(xì)胞，可使腸上皮細(xì)胞受到嚴(yán)重的破壞，影響腸黏膜的完整性，腸粘膜失去屏障作用，引起消化機(jī)能紊亂，營養(yǎng)物質(zhì)吸收不良，飼料轉(zhuǎn)化率降低，藥物就不能起到很好效果。隨著首次劑量的增加，其中各成分劑量接近或超出各自最低有效劑量，從而在柔嫩艾美耳球蟲病發(fā)生的早期阻斷球蟲的侵入，通過阻滯細(xì)胞膜上的鈣離子通道，抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，減少細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度，緩解宿主細(xì)胞的鈣超載，并提高機(jī)體對(duì)各種應(yīng)激的耐受力，促進(jìn)病雞抗損傷作用，達(dá)到療效。

給藥頻率與藥物的半衰期緊密相關(guān)［15］，給藥頻率高，不超出藥物半衰期，藥物生效后一直處于最佳作用期間，可以保證療效；給藥頻率低，超出藥物半衰期，藥效就會(huì)有所波動(dòng)，呈現(xiàn)波峰波谷現(xiàn)象，療效欠佳。

5 結(jié)論

在雞感染柔嫩艾美耳球蟲后第三天（糞便變?。╅_始給藥，于飲水中添加復(fù)方妥曲珠利緩釋微囊，期間分別以不同頻率給予每組雞藥物，各組雞給藥總量相同，試驗(yàn)表明：

（1）4d·次－1、1d·次－1、2d·次－1、3d·次－1用藥組的抗球蟲指數(shù)依次增高，其中，4d·次－1和1d·次－1用藥組只達(dá)到良好抗球蟲效果，2d·次－1和3d·次－1用藥組均可達(dá)高效抗球蟲作用。

（2）1d·次－1、4d·次－1、2d·次－1和3d·次－1用藥組的病變值依次降低，3d·次－1用藥組僅為2.67。

（3）發(fā)病后2次給藥，首次劑量加倍組抗球蟲指數(shù)可達(dá)188.14，高于其它給藥組的 ACI（179.03、182.50、175.98），相對(duì)增重率達(dá)到90.80%，治療效果顯著，可作為的最佳推薦給藥方案。

［1］丁熙成，索勛，MartinW－Shirley.雞球蟲病的疫苗控制及其流行病學(xué)檢測(cè)的手段［J］.國外畜牧學(xué)（豬與禽），1999（6）：45－51.

［2］索勛，李國清.雞球蟲病學(xué)［M］.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998：117－373.

［3］Allen，Danforth.Dietary modulation of avian co－coccidiosis［J］.International Journal for Parasitology，1998（28）：1131－1140.

［4］張善芳，王海軍，芮藝.淺談雞球蟲病的防治［J］.家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，27（6）：240－243.

［5］張萍，季輝，江善祥.雞球蟲防治過程中容易出現(xiàn)的問題［J］.草業(yè)與畜牧，2011（3）：36－37.

［6］王海珍.復(fù)方抗球蟲藥物研制與療效試驗(yàn)［D］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)：2008.

［7］李瑾，鄭明學(xué)，錢銳，等.影響復(fù)凝聚法制備明膠緩釋微囊的因素探討［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，36（6）：207－209.

［8］楊英，郭志廷.苦豆籽粕對(duì)雞球蟲病防治作用的試驗(yàn)研究［J］.動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2004，21（10）：35－37.

［9］張偉信，張西臣，李建華.五種不同地理株柔嫩艾美耳球蟲免疫保護(hù)性比較［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006（4）：454－456.

［10］王繁榮，孫培樂.鈣拮抗劑在消化系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用［J］.中國實(shí)用內(nèi)科雜志，1996，16（7）：437－438.

［11］范運(yùn)峰，鄭明學(xué)，梁文濤.細(xì)胞鈣信息轉(zhuǎn)導(dǎo)與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系［J］.動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)，2004（11）：29－31.

［12］鄭明學(xué)，范運(yùn)峰，韓克光，等.細(xì)胞鈣超載與雞柔嫩艾美爾球蟲病損傷關(guān)系［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006（10）：1053－1057.

［13］顧有方，張文權(quán)，陳會(huì)良.硒和維生素E與柔嫩艾美球蟲感染的關(guān)系［J］.中國獸醫(yī)科技，2003，33（1）：51－53.

［14］Christine A Zuberbuehler，Ruth E Messikommer，Myrtha M Arnold，et al.Effects of selenium depletion and selenium repletion by choice feeding on selenium status of young and old laying hens［J］.Physiology ＆ Behavior，2006，87：430－440.

［15］楊樹勤.衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1992（3）：28.