保加利亞乳桿菌的增菌培養(yǎng)基設(shè)計(jì)及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)研究

戴 遠(yuǎn) 臣，侯 紅 漫，張 公 亮

(大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034)

0 引 言

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)是研究微生物生長(zhǎng)活動(dòng)中菌體的生長(zhǎng)、底物的消耗、產(chǎn)物形成與各種環(huán)境因素相互的作用及內(nèi)在規(guī)律的科學(xué)[1]。近年來(lái)，人們開(kāi)發(fā)了多種數(shù)學(xué)工具軟件，這些軟件在發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型分析中得到了很好的應(yīng)用。尤其是MATLAB軟件，雖然已經(jīng)在科學(xué)界推廣，但它在微生物生長(zhǎng)預(yù)測(cè)模型中的應(yīng)用仍處于摸索階段[2]。目前，尚未見(jiàn)將山楂多糖[3]作為促生因子對(duì)保加利亞乳桿菌增殖作用分析的研究報(bào)告。作者對(duì)保加利亞乳桿菌的增殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，以提高乳酸菌的比生長(zhǎng)速率和菌體濃度，同時(shí)應(yīng)用MATLAB軟件對(duì)Logistic方程[4]進(jìn)行最優(yōu)參數(shù)估計(jì)和非線性擬合，建立了較為合理的菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，以期為分批發(fā)酵提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 菌種與原料

保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus，6047)，由大連工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

山楂多糖采用水提醇沉法制得。山楂加水打漿，90℃熱水浴提取6h，0.1%果膠酶3h后滅酶10min，離心抽濾后進(jìn)行濃縮，95%乙醇醇沉、離心，復(fù)溶于水中后再次醇沉、離心，最后用無(wú)水乙醇反復(fù)洗滌，于50℃烘箱干燥制得山楂多糖。測(cè)得山楂多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為472.2mg／g，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明對(duì)保加利亞乳桿菌有促生作用。

脫脂奶粉：市售伊利脫脂乳粉。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄糖20g，吐溫80 1mL，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0.58g，硫酸錳0.25g，蒸餾1 000mL，pH 6.2～6.6，121℃滅菌10min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及動(dòng)力學(xué)模型

1.2.1 測(cè)定方法

總糖采用苯酚－硫酸法測(cè)定[5]。

菌懸液吸光值(OD600nm)：用UV2102型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600nm條件下比色，測(cè)定菌懸液的吸光值，以接種3%保加利亞乳桿菌的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。細(xì)胞濃度以O(shè)D600nm表示。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

菌種的活化：將保加利亞乳桿菌以3%的接菌量接種于12%的液體脫脂乳中，37℃培養(yǎng)8h，待凝乳后再傳代2次后接種培養(yǎng)。

山楂多糖濃度對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響：將保加利亞乳桿菌以3%接種量分別接入0、1%、2%、3%山楂多糖的 MRS培養(yǎng)基中，每組3個(gè)平行。于42℃培養(yǎng)12h，在600nm下測(cè)定OD值，研究對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響。

pH和溫度對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響：得到山楂多糖最適添加量后，制備不同初始pH(6.0、6.5、7.0)的含有2%山楂多糖的液體 MRS培養(yǎng)基，每組3個(gè)平行。將保加利亞乳桿菌以3%接種量分別接入上述試管當(dāng)中，將3組試管分別在32、37、42℃下培養(yǎng)12h，測(cè) OD600nm(表1)。

表1 不同溫度、pH試管編號(hào)表Tab.1 Number of test tube in different pH and temperature

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)基為山楂多糖優(yōu)化MRS培養(yǎng)基。裝液量為500mL三角瓶300mL，每個(gè)重復(fù)3次，發(fā)酵周期24h，每2h測(cè)定OD600nm，取3次測(cè)定結(jié)果的平均值。

1.2.3 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

為了更好地對(duì)發(fā)酵中菌體的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行描述，實(shí)驗(yàn)采用Logistic模型能較好地?cái)M合分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)過(guò)程：

t＝0時(shí)X＝X0，該方程式的積分式為

式中：X為菌體濃度；dX／dt為菌體生成速率；X0為t＝0時(shí)菌體的初始濃度；Xmax為菌體的最大濃度；μmax為最大比生長(zhǎng)速率，h－1；t為培養(yǎng)時(shí)間，h。

2 結(jié)果與討論

2.1 山楂多糖對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響

如圖1所示，山楂多糖添加量在0～2%，保加利亞乳桿菌OD值隨山楂多糖濃度的增加而上升；多糖濃度繼續(xù)升高，菌體OD值反而下降，結(jié)果表明，并非山楂多糖濃度越高，保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)最旺盛，原因可能是山楂多糖濃度過(guò)高促使培養(yǎng)液滲透壓增大影響其正常的生長(zhǎng)。故2%為山楂多糖的最適添加量。

圖1 不同山楂多糖添加量對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of different hawthorn polysaccharide concentration on the growth of Lactobacillus bulgaricus

2.2 pH和溫度對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響

如圖2所示，處于32℃的不同pH環(huán)境下保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)均較緩慢，處于37℃的保加利亞乳桿菌在pH為6.5生長(zhǎng)比較旺盛。處于42℃、pH為6.5的保加利亞乳桿菌菌體生長(zhǎng)最為旺盛，故最適pH為6.5，最適溫度為42℃。

2.3 優(yōu)化山楂多糖培養(yǎng)基對(duì)保加利亞乳桿菌增殖效果的比較

圖2 在不同pH和溫度條件下，山楂多糖(w＝2%)對(duì)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of hawthorn polysaccharide(w＝2%)on the growth of Lactobacillus bulgaricus at different pH and temperatures

圖3 保加利亞乳桿菌在優(yōu)化增殖培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.3 The growth curve of Lactobacillus bulgaricus in optimized multiplication medium and in MRS medium

菌種活化后，以3%接種量分別接種到優(yōu)化后的含有山楂多糖MRS液體培養(yǎng)基(pH＝6.5)、MRS培養(yǎng)基中，在42℃恒溫培養(yǎng)，測(cè)定生長(zhǎng)曲線，同時(shí)做平行試驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)圖3。通過(guò)保加利亞乳桿菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn)，與正常MRS培養(yǎng)基相比，保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期提前，并且穩(wěn)定期最大吸光度值達(dá)到了0.671，從14h開(kāi)始進(jìn)入衰退期，而且穩(wěn)定期相對(duì)較長(zhǎng)，比正常MRS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)效果明顯。在優(yōu)化培養(yǎng)條件下添加2%山楂多糖可有效促進(jìn)保加利亞乳桿菌生長(zhǎng)，并且培養(yǎng)10h后的最大菌體濃度是正常MRS培養(yǎng)基菌體濃度的1.13倍。

2.4 模型參數(shù)的求解

應(yīng)用MATLAB軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性規(guī)劃，采用最小二乘法，建立誤差平方和最小為目標(biāo)，獲得待估參數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)得到模型參數(shù)的初估值，經(jīng)麥夸特算法逐步迭代進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，不斷修正模型參數(shù)的初估值，直到獲得全局性收斂的最優(yōu)參數(shù)估計(jì)值，其估計(jì)值為μmax＝0.573，Xmax＝1.565。

2.5 模型的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證模型的可靠性，根據(jù)所建立的菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型可得到分批發(fā)酵過(guò)程中菌體濃度隨發(fā)酵時(shí)間變化的擬合值，進(jìn)而計(jì)算出實(shí)測(cè)值與擬合值之間的相對(duì)誤差，結(jié)果如表2所示。從誤差的分布來(lái)看，除發(fā)酵的初期誤差值達(dá)到8.8%外，其他擬合值與實(shí)驗(yàn)值的誤差相對(duì)較小，模型對(duì)發(fā)酵后期菌體生長(zhǎng)的模擬效果相對(duì)較好。說(shuō)明所創(chuàng)建數(shù)學(xué)模型能較好地反映保加利亞乳桿菌在優(yōu)化的培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征。

表2 模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值的比較Tab.2 Comparison of experimental value and fitted value of models

3 結(jié) 論

保加利亞乳桿菌在2%的山楂多糖、pH為6.5、溫度為42℃條件下生長(zhǎng)最為旺盛。在優(yōu)化后的山楂多糖培養(yǎng)基中最大菌體濃度是正常MRS培養(yǎng)基中菌體濃度的1.13倍。

得到保加利亞乳桿菌在優(yōu)化培養(yǎng)基中分批培養(yǎng)的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程為dX／dt＝0.573(1－X／1.565)X，擬合值和實(shí)驗(yàn)值相對(duì)誤差在10%范圍內(nèi)，能較好地反映保加利亞乳桿菌在優(yōu)化的培養(yǎng)基中菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)特征。

[1]韓潤(rùn)林，陳洪章，李佐虎.枯草桿菌溶栓酶恒溶氧發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)估計(jì)[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào)，2002，2(1)：55－57.

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