淺談蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)與轉(zhuǎn)擴(kuò)改革

楊輝德

(黃岡職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物化工學(xué)院，湖北 黃岡 438002)

天麻是名貴中藥材，現(xiàn)已由傳統(tǒng)醫(yī)用發(fā)展到飲食及滋補(bǔ)保健等行業(yè)，社會(huì)需求量急增，導(dǎo)致天麻種植的共生菌蜜環(huán)菌菌種生產(chǎn)量也與日俱增。但隨著對(duì)蜜環(huán)菌生長(zhǎng)習(xí)性認(rèn)識(shí)的逐步深入，筆者發(fā)現(xiàn)蜜環(huán)菌母種生產(chǎn)中存在的一些問(wèn)題。一是蜜環(huán)菌母種在斜面培養(yǎng)生長(zhǎng)不理想;二是蜜環(huán)菌在瓊脂培養(yǎng)基上極易產(chǎn)生褐化及角質(zhì)化，使菌種發(fā)生退化;三是傳統(tǒng)從試管表面轉(zhuǎn)管與擴(kuò)繁容易導(dǎo)致污染。上述問(wèn)題均影響了制作蜜環(huán)菌母種的質(zhì)量與轉(zhuǎn)擴(kuò)成功率。通過(guò)對(duì)上述問(wèn)題的試驗(yàn)探索，在借鑒他人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行大膽的探索與改革，很好地解決了上述問(wèn)題，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 蜜環(huán)菌母種的生產(chǎn)與轉(zhuǎn)擴(kuò)中存在的問(wèn)題

在多年培養(yǎng)蜜環(huán)菌母種實(shí)踐中，開(kāi)始對(duì)蜜環(huán)菌不太了解，在培養(yǎng)基配制、試管分裝、母種轉(zhuǎn)管與擴(kuò)繁中總按對(duì)待其它食用菌的辦法進(jìn)行操作，并沒(méi)有考慮蜜環(huán)菌生長(zhǎng)的個(gè)性要求。在實(shí)際生產(chǎn)中出現(xiàn)一些不盡人意的事情，如斜面培養(yǎng)菌種量過(guò)小、PDA培養(yǎng)基種性易退化、從試管表面接種易污染等問(wèn)題。

1.1 試管斜面培養(yǎng)菌種量小

傳統(tǒng)上蜜環(huán)菌母種采用試管斜面培養(yǎng)，主要考慮增加菌種與氧氣的接觸面積，通常是18 mm×180 mm試管裝7 mL～8 mL，或20 mm×200 mm試管裝10 mL～12 mL，所裝高度只占試管1/5～1/4 之間。擺成斜面后高度占試管 1/2 ～3/5 之間，所裝液量較少，培養(yǎng)母種量有限。

1.2 PDA培養(yǎng)基種性易退化

蜜環(huán)菌母種制作，不管是菌種制作廠家還是天麻種植者，大多采用傳統(tǒng)的PDA、PDA加富或PDA+黃豆粉等培養(yǎng)基。這些傳統(tǒng)培養(yǎng)基有許多不足之處一是不能為蜜環(huán)菌提供充分的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源;二是由于蜜環(huán)菌是喜濕性菌類，在培養(yǎng)基上更易吸收游離態(tài)水，而傳統(tǒng)的瓊脂培養(yǎng)基以結(jié)合態(tài)水為主要存在形式，不能很好地為其提供所需水分，致使蜜環(huán)菌的生長(zhǎng)受到一定抑制;三是在瓊脂培養(yǎng)基上，菌種容易產(chǎn)生褐化及角質(zhì)化，這是蜜環(huán)菌退化的標(biāo)志，因而影響了培養(yǎng)母種的質(zhì)量，降低了天麻生產(chǎn)產(chǎn)量。

1.3 固體培養(yǎng)生長(zhǎng)不理想

傳統(tǒng)的蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)均采用瓊脂作凝固劑，這都源于對(duì)蜜環(huán)菌缺乏了解。蜜環(huán)菌是喜濕性菌類，更易于吸收游離態(tài)水，在瓊脂作凝固劑中以白色菌索形式出現(xiàn)，但分枝較少;而在原料為主的半固體培養(yǎng)基中也以白色菌索形式出現(xiàn)，但分枝較多，生長(zhǎng)更旺。

1.4 從試管表面接種易污染

在后期生長(zhǎng)中，蜜環(huán)菌母種在菌柱表面分泌色素形成老菌皮，上面還形成菌索伸向試管口。因而從試管表面接種增加了接種操作難度，同時(shí)隨著保藏時(shí)間的延長(zhǎng)，母種菌柱上部會(huì)失水干縮并產(chǎn)生色素，這一部分菌種更容易出現(xiàn)退化問(wèn)題;再者菌種在長(zhǎng)期保藏中菌種表面可能有雜菌，致使從試管表面接種易污染，母種轉(zhuǎn)管與擴(kuò)繁成功率不高。

2 蜜環(huán)菌母種生產(chǎn)與轉(zhuǎn)擴(kuò)的改革方法

2.1改試管斜面為試管菌柱

由于蜜環(huán)菌母種能以菌索方式存在，菌索有輸送氧氣的能力。因此，蜜環(huán)菌母種培養(yǎng)可改用試管菌柱方式進(jìn)行。試管菌柱制作減少了擺斜面的操作環(huán)節(jié)，菌柱高度與試管斜面同樣只占試管1/2～3/5之間，用18 mm×180 mm試管裝液量為18 mL～20 mL，20 mm×200 mm試管裝液量23 mL～25 mL，裝液量是試管斜面的2.5倍。試管菌柱培養(yǎng)的母種見(jiàn)圖1，從而在同樣的容器中提高了母種的生產(chǎn)數(shù)量，節(jié)約成本，提高效益。

2.2 改固體方式為半固體方式

使用玉米粉100 g、黃豆粉10 g、麥麩80 g、蔗糖 (白糖)20 g、水1 000 mL作培養(yǎng)蜜環(huán)菌母種的的配方。培養(yǎng)基的狀態(tài)呈半固體狀，具有流動(dòng)性。先將稱量好的玉米粉、黃豆粉、麥麩用適量水調(diào)勻。再添足水煮制，待煮沸時(shí)開(kāi)始記時(shí)，保持35 min即可，注意在加熱過(guò)程中需不時(shí)攪拌，以免煮糊。注意適量添水，以補(bǔ)充加熱過(guò)程中損失的水分。煮好后加入所需的蔗糖，趁熱采用注射筒或其他裝置分裝。分裝后塞好棉塞，將試管豎直放置。由于該培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)相當(dāng)豐富，再加上玉米粉徹底滅菌相對(duì)較難。因此滅菌時(shí)間應(yīng)比常規(guī)培養(yǎng)基稍長(zhǎng)一點(diǎn)，一般將其控制在高壓條件下0.15 MPa下滅菌35 min～40 min。滅菌完成后，待冷卻至試管不燙手時(shí)將其取出，豎直放置，待完全冷卻后再開(kāi)始接種操作。采用玉米粉等原料半固體方式培養(yǎng)的蜜環(huán)菌母種見(jiàn)圖2。

2.3 改PDA培養(yǎng)基為綜合培養(yǎng)基

用傳統(tǒng)的PDA、PDA加富、PDA+黃豆粉等培養(yǎng)基培養(yǎng)蜜環(huán)菌母種，菌種呈菌索狀，菌索生長(zhǎng)粗狀，分枝也多，在菌柱表面分泌的色素多，易形成褐化及角質(zhì)化。而用馬鈴薯100 g、木屑 50 g、麥麩 50 g、玉米粉 50 g、瓊脂 10 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB110 mg、水1 000 mL的綜合配方培養(yǎng)蜜環(huán)菌母種，培養(yǎng)的母菌呈菌絲狀，菌絲分枝細(xì)密，生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，日平均生長(zhǎng)速度達(dá)5.18 mm·d－1。且經(jīng)1年時(shí)間保藏失水不嚴(yán)重、耐貯藏，與PDA培養(yǎng)基配母種質(zhì)量有顯著差異，在推廣中增產(chǎn)明顯。

2.4 改試管表面轉(zhuǎn)擴(kuò)為試管底部破碎轉(zhuǎn)擴(kuò)

鑒于蜜環(huán)菌母種從試管表面接種易污染的現(xiàn)實(shí)，筆者進(jìn)行了多次改從試管底部破碎轉(zhuǎn)擴(kuò)試驗(yàn)，成功率高達(dá)98%。具體操作步驟如下:第一步挑選健壯的母種試管;第二步在試管下半部菌柱的部位用寬透明膠帶纏繞并用75%酒精消毒;第三步在超凈工作臺(tái)或接種箱中敲碎管底，無(wú)菌操作中一只手拿試管口棉塞處，另一只手用鑷子從試管底部破碎處挑取母菌進(jìn)行轉(zhuǎn)擴(kuò)接種。操作步驟與操作方法見(jiàn)圖3。

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