外源鈣對香菇富集重金屬的抑制作用1）

李海波，魏海龍，胡傳久，付立忠，吳學(xué)謙，吳慶其

（1.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，杭州 310023；2.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，杭州310013）

大型真菌對重金屬生物富集現(xiàn)象的認(rèn)識始于20世紀(jì)70年代蘑菇屬（Agaricus）真菌內(nèi)鎘（Cd）的高水平積累的發(fā)現(xiàn)，隨后人們紛紛發(fā)現(xiàn)很多大型真菌都具有較強富集重金屬如汞（Hg）、Cd、鉛（Pb）、砷（As）、銅（Cu）等的能力和作用。與綠色植物相比，食用菌能夠積累更高濃度的鉛Pb、Cd和Hg等有害重金屬［1－4］。重金屬在食用菌的不同生長發(fā)育期是必需元素，當(dāng)處于痕量水平時可促進(jìn)食用菌的生長，并維持所需重金屬在體內(nèi)的動態(tài)平衡；但是當(dāng)重金屬含量超過一定濃度時，則對食用菌形成脅迫毒害作用。香菇是著名的食（藥）用大型真菌，其產(chǎn)量位居所有食用菌類的前三位，在我國食用菌出口貿(mào)易中占有重要地位。近年來有大量有關(guān)香菇等食用菌重金屬含量的分析檢測、背景值測算和富集規(guī)律的研究報道。這些研究均表明，香菇對于重金屬元素Pb、Cd、Hg和As具有極強的富集能力，重金屬可積累在香菇的子實體部分，并通過食物鏈進(jìn)入人體，危害人體健康［5－12］。在自然界中，微量元素并不是單獨存在的，而且在微量元素之間存在著相互制約的現(xiàn)象，影響著生物對它們的吸收利用。對重金屬蓄積植物的研究表明，礦質(zhì)元素鈣（Ca）可以與重金屬Cd競爭植物根系上吸收位點，從而降低植物對Cd的吸收［13］。添加外源Ca可以增強植物對許多非生物逆境的適應(yīng)性，減輕逆境對植物所造成的傷害［14］，其機理可能是通過對有害礦質(zhì)元素的拮抗作用［15］、維持較高的抗氧化保護酶系統(tǒng)活力［16］以及發(fā)揮鈣信使系統(tǒng)的功能［17］等。因此，借鑒Ca對植物抗逆境的保護作用，通過外源Ca的添加來緩解重金屬對香菇等栽培食用菌的脅迫毒害作用、抑制其對重金屬的超量富集是值得探索的一條思路，但迄今為止，在食用菌研究領(lǐng)域，無論在基礎(chǔ)研究層面上，還是應(yīng)用技術(shù)層面上，尚缺乏礦質(zhì)元素（如Ca、Mg、Zn）對重金屬富集影響的研究，缺乏利用外源礦質(zhì)元素對重金屬富集的阻斷技術(shù)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 香菇菌種

香菇（Lentinual edodes）菌種939，由麗水市食用菌研究開發(fā)中心提供。

1.1.2 配方

（1）母種培養(yǎng)基配方：2% 葡萄糖、0.2% 酵母粉、0.1%KH2PO4、0.05%MgSO4·7H2O、瓊脂若干。

（2）含重金屬液體培養(yǎng)基配方：在含3% 豆餅粉、2% 葡萄糖、1% 酵母粉、0.5% 蛋白胨、1% 維生素B1、0.1%KH2PO4和0.05%MgSO4·7H2O的液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加Pb 150mg／L、Cd 20mg／L、As 5mg／L、Hg 20mg／L形成4種含重金屬培養(yǎng)基。每種重金屬培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.1、0.5、1.5、3.0g／L的Ca2＋形成4個處理，不添加Ca2＋作為對照。

（3）含重金屬栽培基質(zhì)配方：在含78%木屑、20%麩皮，水適量的栽培基質(zhì)基礎(chǔ)上，分別添加如表1所示的重金屬量。再在每種含重金屬的栽培基質(zhì)中分別添加1%、2%、4%、6%的含Ca2＋礦質(zhì)添加劑形成4個處理，不添加Ca2＋礦質(zhì)添加劑作為對照。栽培基質(zhì)裝袋制成15cm×55cm的香菇菌棒。

表1 不同重金屬的添加量及菌棒實測值 mg·kg－1

1.1.3 試劑

4種重金屬 Pb［Pb（CH3COO）2·3H2O］、Cd（CdCl2·2.5H2O）、As（As2O3）、Hg（HgCl2）和礦物質(zhì)Ca（CaCl2）均購自浙江華東醫(yī)藥器化公司。添加在香菇培養(yǎng)基中的重金屬離子和礦物質(zhì)離子均按照分子量換算成相應(yīng)的離子含量，按照添加量的濃度配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中Pb、Cd、Hg是溶于水中配制而成，As是溶于20%的氫氧化鈉溶液中配制而成，礦物質(zhì)Ca是溶于水中配制而成。

1.2 方法

1.2.1 液體培養(yǎng)方法：試驗前將香菇菌種轉(zhuǎn)接至PDA斜面活化，24℃培養(yǎng)5天。在500mL三角瓶中裝200mL母種培養(yǎng)基，于121℃滅菌30min。從活化好的斜面菌種上取5塊0.3cm×0.3cm大小菌種塊接種三角瓶中，置搖床上培養(yǎng)（26℃，轉(zhuǎn)速200 r／min）3天。之后取10%轉(zhuǎn)接入含重金屬的液體培養(yǎng)基，置搖床上培養(yǎng)（26℃，轉(zhuǎn)速200r／min）25天后，紗布過濾，菌絲體蒸餾水沖洗后，3000r／min離心15min，棄上清液后，稱重。每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)10個搖瓶。

1.2.2 固體基質(zhì)培養(yǎng)方法：在香栽培基質(zhì)添加如表1所示的重金屬和含Ca2＋礦質(zhì)添加劑，裝袋制成香菇菌棒，滅菌后接種香菇膠囊菌種，接種后的培養(yǎng)溫度為25～26℃，按常規(guī)進(jìn)行菌棒培養(yǎng)管理，采用高棚層架栽培模式進(jìn)行出菇管理。出菇后收獲子實體檢測重金屬含量。每個處理設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)25個菌棒。

1.2.3 重金屬含量檢測方法：Hg總量測定（GB／T5009.17－2003）：冷原子吸收光譜法即五氧化二釩消化法檢測；As總量測定（GB／T5009.11－2003）：氫化物原子熒光光度法檢測；Pb總量測定（GB／T5009.12－2003）：石墨爐原子分光光度法進(jìn)行檢測；Cd總量測定（GB／T5009.15－2003）：石墨爐原子分光光度法進(jìn)行檢測。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 11.0軟件，對所有數(shù)據(jù)均以平均均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，各處理間的比較采用最小顯著差值法LSD－t檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ca2＋對培養(yǎng)基污染Pb、Cd、As、Hg的香菇菌絲體生物量的影響

Ca2＋對培養(yǎng)基污染Pb、Cd、As、Hg的香菇939菌絲體生物量產(chǎn)生了較大影響（表2）。在含有Pb、Cd、As、Hg的液體培養(yǎng)基中生長的香菇939，在未添加Ca2＋時，其菌絲體生物量分別為0.014、0.245、0.410和0.0820g／100mL，添加 Ca2＋后，其菌絲體生物量呈現(xiàn)增加的趨勢，當(dāng)Ca2＋添加量達(dá)到3g／L時，培養(yǎng)基中含有Pb、Cd、Hg的香菇939的菌絲體生物量達(dá)到最大值，分別為0.709、0.85和2.332g／100mL，分別是未添加Ca2＋的50.6、3.5和5.7倍。在含As的培養(yǎng)基中，Ca2＋的添加量為0.1g／L時，香菇939的菌絲體生物量就達(dá)到了最大值0.44g／100mL，是未添加Ca2＋的5.4倍，繼續(xù)增加Ca2＋的含量，菌絲體生物量呈現(xiàn)下降的趨勢。這表明在4種重金屬的脅迫作用下，香菇的生長均不同程度地受到抑制，而外源添加的Ca2＋可能通過離子拮抗作用降低了香菇子實體對4種重金屬離子的大量吸收，進(jìn)而減輕重金屬對香菇的毒害作用。同時，在Ca2＋的拮抗效果上，Ca2＋對As富集的拮抗在低添加量（0.1g／L）時已達(dá)到最大，而對Pb、Cd、Hg富集的拮抗在高添加量（3.0g／L）時尚未達(dá)到最大。

表2 Ca2＋對培養(yǎng)基污染重金屬的香菇939菌絲體生物量的影響 g·100mL－1

2.2 含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對香菇富集重金屬Pb、Cd、As、Hg的影響

由表1可見，即使在香菇固體栽培基質(zhì)中不添加任何濃度的重金屬元素，但在菌棒中依然可以檢出4種重金屬Pb、Cd、As、Hg的存在，這表明香菇培養(yǎng)料（包括木屑、麩皮等）和產(chǎn)地環(huán)境中的土壤、水均含有一定濃度的重金屬元素。在人為添加一定濃度的重金屬元素后，菌棒中的4種重金屬含量顯示出了較大程度的增加，Pb、Cd、As、Hg分別由1.10、0.07、0.19、0.02增至35.06、1.20、6.45、0.89mg／kg干料重。這表明在香菇栽培過程中，外源污染的重金屬元素在栽培菌棒中得到富集，在菌棒中高含量的重金屬元素通過菌絲進(jìn)一步向子實體遷移，進(jìn)而導(dǎo)致子實體大量富集重金屬。

我們近年來的研究結(jié)果已表明，香菇栽培基質(zhì)中的重金屬可以通過菌絲體的吸收、富集并進(jìn)一步遷移到香菇子實體中，栽培者可以從源頭上通過控制培養(yǎng)料中的重金屬限量或阻斷遷移途徑來控制香菇子實體中重金屬含量［18］。在本研究中，我們嘗試通過使用含Ca2＋礦質(zhì)添加劑來阻斷香菇子實體對4種重金屬的富集。由圖1可見，在不添加含Ca2＋礦質(zhì)添加劑時，香菇子實體中4種重金屬Pb、Cd、As、Hg的含量分別為1.20、2.70、1.53、1.39mg／kg，隨著含Ca2＋礦質(zhì)添加劑在香菇培養(yǎng)料中添加濃度從1%、2%、4%到6%的逐步提高，4種重金屬的含量呈不斷下降趨勢，在最高添加濃度為6%時，Pb、Cd、As、Hg的含量分別下降到了0.45、1.43、0.69和0.28mg／kg，分別降低了62.5%、47.0%、54.9%、79.9%。這表明Ca2＋可能通過離子拮抗作用降低了香菇子實體對4種重金屬離子的大量吸收。對南美蟛蜞菊（Wedelia trilobata）毛狀根毒害的生理機理研究表明10～30mM Ca2＋可顯著減少毛狀根對Cd2＋的吸收和吸附，并可調(diào)節(jié)其抗氧化酶活性，降低其膜脂過氧化水平而解除重金屬Cd對毛狀根生長的抑制或毒害［19］。此外，對金針菇、平菇的富集重金屬研究表明，Cd與鋅（Zn）之間存在互相拮抗作用［19］，Ca2＋、鎂（Mg2＋）、鐵（Fe2＋）對 Hg2＋抑制平菇菌絲生長的毒害有一定的拮抗解毒效果［20］。

圖1 不同濃度含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對香菇富集重金屬的影響

2.3 含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對香菇富集重金屬影響的差異顯著性

表3 含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對香菇富集重金屬影響的差異顯著性

由表3的LSD－t檢驗可見，含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對Pb、Hg、As 3種重金屬富集的抑制作用在不同的濃度水平上均存在極顯著差異；在對Cd富集的抑制作用上，4%和6%的含Ca2＋礦質(zhì)用量與CK、1%、2%用量差異顯著。這表明在香菇培養(yǎng)料中添加含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對Pb、Hg、Cd、As 4種重金屬富集均有抑制作用，香菇子實體中Pb、Hg、Cd、As含量均會隨著Ca2＋礦質(zhì)添加量的增加而降低，但Cd只有在Ca2＋礦質(zhì)添加量達(dá)4%和6%時，才明顯降低。這一結(jié)果提示在香菇栽培生產(chǎn)中，可以通過在栽培基質(zhì)配方中添加含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對Pb、Hg、Cd、As 4種重金屬的富集進(jìn)行阻斷，但針對不同的重金屬的阻斷效果，添加含Ca2＋礦質(zhì)的用量有所不同。

3 結(jié)論

3.1 香菇液體培養(yǎng)基中添加一定濃度的Ca2＋可以顯著減輕4種重金屬Pb、Cd、As、Hg對香菇生長的脅迫毒害作用，增加重金屬脅迫下香菇菌絲體的生物量；

3.2 香菇栽培基質(zhì)中添加一定量的含Ca2＋礦質(zhì)添加劑可顯著抑制子實體對4種重金屬離子的大量富集；

3.3 本研究結(jié)果提示在香菇栽培生產(chǎn)中，可以通過在栽培基質(zhì)配方中添加一定量的含Ca2＋礦質(zhì)添加劑對4種重金屬進(jìn)行阻斷。

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