膀胱尿路上皮癌中Syk mRNA及蛋白的表達及其意義

劉鵬舉 胡恩平 張海濤 燕東亮 (溫州醫(yī)學院第一臨床學院，浙江 溫州 325000)

世界范圍內，膀胱癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第九位。其中尿路上皮癌的發(fā)病率最高，對于膀胱尿路上皮癌的研究日益引起人們的重視。Syk基因被認為是一種候選抑癌基因，本研究探討膀胱尿路上皮癌組織中Syk基因的表達及意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本收集 2009年1月至2011年5月浙江省臺州市立醫(yī)院泌尿外科手術切除的膀胱尿路上皮癌標本及正常膀胱黏膜組織，手術切除標本20 min內放于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｆ渲心行?7例，女性15例，年齡43～76歲，腫瘤組織均經病理證實，所有患者術前未接受化療或放療。

1.1.2 主要儀器及試劑 PCR儀器為ABI公司產品，垂直電泳槽為北京六一儀器廠產品。RNA提取試劑盒Trizol(南京凱基生物有限公司);Quant cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生物科技有限公司);RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒(天根生物科技有限公司);聚丙烯酰胺凝膠試劑盒(碧云天);ECL試劑盒(碧云天);顯影定影液(南京凱基生物有限公司);兔抗人syk多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗(南京凱基生物有限公司);兔抗人GAPDH單克隆抗體(cell signaling公司)。

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR 取-80℃保存的膀胱尿路上皮癌及正常膀胱組織50～100 mg，采用Trizol提取組織中總RNA，用紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度，要求A260/A280=1.8 ～2.0，cDNA 合成(20 μl反應體系):取 2 μgRNA，加 2 μl 10 × RT mix，2 μl dNTP 混合液，2 μl Oligo-dT15，1 μl Quant Reverse Transcriptase，加 RNase Free dH2O 至終體積 20 μl，于37℃孵育60 min。采用SYBR Green熒光染料，參照試劑盒說明完成實時定量 PCR，20 μl反應體系包括:2.5×RealMasterMix/20 × SYBR solution 混合反應液 9 μl，cDNA 溶液 2 μl，上下游引物(100 nmol/L)各 2 μl，ddH2O 補足至 20 μl，每個樣本重復3次。GAPDH基因 PCR反應條件為:預變性95℃ 2 min，95℃ 15 s，65 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，共 40個循環(huán);最后 95 ℃15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s收集熒光信號，進行融解曲線分析。獨立實驗重復3次反應結束。記錄各個組織CT值，取平均值。結果采用相對定量法計算。引物序列見表1。

表1 Syk GAPDH的引物序列

1.2.2 Western印跡 取25 mg組織加入500 μl T-PER組織總蛋白提取液(含0.1%PMSF)，在冰上充分碾磨，離心5 min，收集上清液。BCA法檢測蛋白濃度，取30 μg總蛋白進行電泳。SDS-PAGE凝膠的分離膠濃度的用5%和10%檢測Syk和GAPDH，濃縮膠的濃度為5%，蛋白分離后，濕轉法將膠上的蛋白轉移至硝酸纖維膜上，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h，加兔抗人Syk抗體(1∶1 000)、兔抗人 GAPDH 抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。二抗為用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG抗體(1∶1 000)，室溫孵育1.5 h，用化學發(fā)光法(ECL)顯色，進行X線片曝光顯影，實驗中檢測GADPH蛋白表達水平作為內參照，利用圖像分析系統(tǒng)對X線膠片上的條帶進行吸光度值分析，以Syk蛋白條帶與GAPDH蛋白條帶吸光度值的比值作為 Syk蛋白表達的相對強度。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，每項實驗重復3次，熒光定量 PCR檢測的SykmRNA的表達結果以2-ΔΔCt分析，癌組織與癌旁組織中的SykmRNA及Syk蛋白的表達差異采用配對t檢驗，用Kruskal-Wallis法分析Syk mRNA的表達與臨床特征的關系。

2 結果

2.1 Syk mRNA表達分析 Syk mRNA在膀胱癌的表達與其對應在正常膀胱組織中的表達比較，Syk mRNA在尿路上皮癌組織中的表達低于在正常膀胱組織中的表達量。Syk mRNA在膀胱尿路上皮癌組織中的表達是正常黏膜組織中的0.516倍(P＜0.05，t=11.607)。癌組織中的Syk mRNA的表達與癌組織的病理分期及病理分級呈負相關性(P＜0.05)見表2，病理分期及分級越高則Syk的表達水平越低。

2.2 Syk蛋白表達分析 Western印跡結果顯示Syk蛋白在膀胱尿路上皮癌組織及正常膀胱黏膜組織中均有表達(見圖1)，但在膀胱尿路上皮癌組織中的表達為正常組織的0.575倍(P ＜0.05，t=10.471)。

表2 Syk mRNA在癌組織的表達及其與臨床特征的關系

圖1 Western印跡檢測Syk蛋白在膀胱尿路上皮癌及癌旁正常黏膜組織表達

3 討論

Syk是一種非受體酪氨酸激酶，蛋白質相對分子質量為72×103，由629個氨基酸組成，其編碼基因為Syk基因，位于人類染色體 9q22〔1〕，最早由日本學者 Taniguchi等〔2〕在 1991 年從豬脾cDNA克隆出來。Coopman等〔3〕首先發(fā)現正常乳腺組織中有Syk基因的表達，而浸潤性乳腺癌組織中沒Syk基因的表達。之后多項研究檢測到乳腺癌、胃癌、結直腸癌、子宮內膜癌等多種腫瘤細胞也存在Syk基因表達缺失，并根據實驗結果推斷Syk基因可能是一種候選的抑癌基因〔4～7〕。

有研究表明Syk的表達缺失致會導致T細胞、B細胞活化障礙，失去了對異化細胞的監(jiān)測作用，從而導致腫瘤的形成和轉移〔8〕。Mahabeleshwar等〔9〕認為 Syk 通過抑制磷酯酰肌醇 3(PI-3)激酶的活性，從而抑制腫瘤細胞的分裂和核因子NF-κB調節(jié)的人尿激酶型纖溶酶原激活物的激活分泌，而PI-3激酶與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移相關，是許多酶原激活的起點，在血管內皮細胞正常生長、分化、遷移及生存過程中起著重要的作用。有研究還顯示Syk可抑制HER2/neu收縮血管內皮細胞的作用從而抑制腫瘤的轉移，因此認為Syk與HER2/neu是一對功能相反的抑癌/癌基因〔10〕。

目前用于診斷和監(jiān)測膀胱腫瘤的兩種主要方法是尿細胞學檢查和尿道膀胱鏡檢，但前者敏感性較差，后者為有創(chuàng)性檢查。因此尋找一種特異性、敏感性較高，能監(jiān)測膀胱尿路上皮癌的腫瘤標記物，用于指導臨床工作顯得尤為重要。因此從分子水平診斷膀胱尿路上皮癌，探討其發(fā)生、發(fā)展的機制成為各家學者研究的熱點〔11〕。

本研究，表明Syk基因在膀胱尿路上皮癌的發(fā)生發(fā)展過程中起抑制作用，同時Syk mRNA在癌組織的表達水平低于對應癌旁組織的表達水平這一結果。對于Syk基因的進一步研究，必將對膀胱尿路上皮癌的診斷和治療提供新的思路。目前，Syk在膀胱尿路上皮癌中促進腫瘤細胞的生長與轉移的具體作用機制等仍不清楚，仍可以進行更為深入的研究。再者，腫瘤一直以來被認為是遺傳性疾病，即由于DNA序列發(fā)生改變而導致。隨著研究的深入，人們發(fā)現腫瘤的產生不僅僅是DNA序列發(fā)生改變，一些DNA序列不發(fā)生改變同樣可以導致腫瘤的發(fā)生，即表觀遺傳學改變。膀胱上皮癌組織中Syk基因表達下降是因為DNA序列的改變或是表觀遺傳學改變尚不能說明。在今后的研究中尚需進一步探索Syk基因在膀胱尿路上皮癌的生成、轉移過程中的具體機制，為將來防治膀胱尿路上皮癌提供新的思路十分必要。

1 Heizmann B，Reth M，Infantino S.Syk is a dual-specificity kinase that self-regulates the signal output from the B-cell antigen receptor〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2010;107(43):18563-8.

2 Taniguchi T，Kobayashi T，Kondo J，et al.Molecular cloning of a porcinegene Syk that encodes a 72-KD a protein-tyrosine kinase showing highsusceptibility to protelysis〔J〕.J Biol Chem，1991;266(24):15790-6.

3 Coopman PJ，Do MT，Barth M，et al.The Syk tyrosine kinase suppressesmalignant growth of human breast cancer cells〔J〕.Nature，2000;406(8):742-7.

4 Moorni M，Soldatenkov V，Zhang L，et al.Progressive loss of Syk and abnormal proliferation in breast cancer cells〔J〕.Cancer Res，2004;64(20):7346-54.

5 Hoeller C，Thallinger C，Pratscher B，et al.The non receptor associated tyrosine kinase Syk is a regulator of metastatic behavior in human melanoma cells〔J〕.J InvestDermatol，2005;124(6):1293-9.

6 Nakashima H，Natsugoe S，Ishigami S，et al.Clinical significance of nu-clear expression of spleen tyrosine kinase(Syk)in gastric cancer〔J〕.Cancer Lett，2006;236(1):89-94.

7 Frank J，Rauseher Ⅲ.It is time for a human epigenome project〔J〕.Cancer Res，2005;65(24):11229.

8 Goodman PA，Wood CM，Vassilev A，et al.Spleen tyrosine kinase deficiency in childhood pro-B cell acute lymphoblastic leukemia〔J〕.Onco Gene，2001;20(30):3969-78.

9 Mahabeleshwar GH，Kundu GC.Syk，a protein-tyrosine kinase，suppresses the cell motility and nuclear factor kappa B-mediated secretion of urokinase type plasminogen activator by inhibiting the phosphatidylinositol 3'-kinase activity in breast cancer cells〔J〕.J Bilo Chem，2003;278(8):6209-21.

10 Carter WB，Hoying JB，Boswell C，et al.HER2/neu over expression induces endothelial cell retraction〔J〕.Int J Cancer，2001;91(3):295-9.

11 Cordon-Cardo C.Molecular alterations associated with bladder cancer initation and progression〔J〕.Scand J Urol Nephrol Suppl，2008;(218):154-65.