大鼠牙齒移動過程中牙周組織MMP-2、TIMP-2的表達(dá)

蘇哲君 王 鵬 陳志宏 (承德醫(yī)學(xué)院口腔科，河北 承德 067000)

正畸治療是牙齒、頜骨接受矯治力，牙周膜、牙槽骨受力后發(fā)生一系列生物學(xué)反應(yīng)，引起牙周組織的更新改建，牙齒移動到新的位置，達(dá)到矯治目的〔1〕。目前認(rèn)為，正畸牙齒的移動依賴于正畸力作用下牙周組織細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解、合成，通過ECM降解與合成的動態(tài)平衡得以實現(xiàn)〔2〕。研究證明〔3〕:基質(zhì)金屬蛋白酶及金屬蛋白酶組織抑制因子(MMPs/TIMPs)在ECM的更新重建過程中發(fā)揮重要作用。本文采用SD大鼠來構(gòu)建牙齒移動的模型，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法檢測正畸力值作用下MMP-2、TIMP-2的濃度變化，探討正畸力對大鼠牙周組織中MMP-2、TIMP-2表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及牙移動模型的建立 清潔級雄性SD大鼠42只，體重200～250 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號:712024。大鼠隨機(jī)分為6組，每組7只:正常對照組(0 d 組)、正畸加力1、4、7、14、21 d 組，適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 w 后開始進(jìn)行試驗。

1.2 牙移動模型的建立 將鹽酸氯胺酮100 mg/kg、托品0.5 mg、安定5 mg混合稀釋至10 ml，以0.75 ml/100 g的劑量采取腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠，麻醉成功后將大鼠固定，牽拉開口角后牽出舌頭，將左側(cè)上頜第1磨牙牙齦用探針剝離后，用專用的牙科慢速手機(jī)在上頜中切牙牙頸部以及上頜左側(cè)第1磨牙近中鄰面磨出深度大約為0.5 mm左右的溝槽，并將0.20 mm細(xì)結(jié)扎絲穿過上頜左側(cè)第1、2磨牙之間，把結(jié)扎絲緊密扎在上頜左側(cè)第1磨牙牙頸部溝槽內(nèi)，鎳鈦拉簧固定在環(huán)繞左側(cè)第1磨牙的結(jié)扎絲中，且拉簧的遠(yuǎn)中位于第1磨牙的近中，再將另一端環(huán)繞兩中切牙的結(jié)扎絲穿入拉簧，拉伸鎳鈦拉簧，在測力計顯示拉伸力值為50 g時，結(jié)扎固定。把上頜左側(cè)第1磨牙視為移動牙齒，左右中切牙視為支抗牙，左上第1磨牙近中向牽引移動。正常對照組大鼠不做處理。

1.3 標(biāo)本制備 在實驗大鼠上正畸裝置后的預(yù)定終止時間(1，4，7，14，21 d)采用 3%戊巴比妥鈉全麻的方法分別處死各組大鼠。取左側(cè)上頜骨，拔除左側(cè)上頜第1磨牙后切取第1磨牙處牙槽骨，電子天平分別稱重，按1 ml/mg的比例分別加入生理鹽水，低溫快速勻漿，低溫離心，提取上清液，分別放入Eppendorf管中，-20℃冰箱保存。采用ELISA方法檢測牙槽骨中MMP-2與TIMP-2含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 磨牙移動距離觀察 觀察大鼠牙齒移動第7天時，發(fā)現(xiàn)實驗組大鼠第1磨牙與第2磨牙間均已出現(xiàn)間隙，在21 d時實驗組大鼠左側(cè)第1磨牙向近中移動所形成的間隙明顯。實驗組與對照組相比，大鼠牙齒移動間隙實驗組明顯大于對照組。不同正畸力作用下大鼠牙槽骨中MMP-2的濃度變化。

2.2 50 g正畸力作用下大鼠牙槽骨中MMP-2的濃度變化加50 g正畸力后大鼠牙槽骨中MMP-2的濃度開始升高，在加力后4、7 d時增高明顯，7 d達(dá)到峰值，而后開始下降，到21 d又恢復(fù)至加力前的水平。與加力前比較，MMP-2的濃度在加力后4、7、14 d升高存在顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.3 50 g正畸力作用下牙槽骨TIMP-2的濃度變化 在加力后1 d TIMP-2濃度開始緩慢升高，到7 d時達(dá)到高峰，之后開始下降，21 d左右恢復(fù)至加力前水平。與加力之前比較，加力后4、7、14 d時 TIMP-2濃度升高有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠牙槽骨中MMP-2和TIMP-2各時間點含量(±s，mmol/L，n=7)

表1 大鼠牙槽骨中MMP-2和TIMP-2各時間點含量(±s，mmol/L，n=7)

與0 d比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05

組別MMP-2 TIMP-2 0 d 12.35±1.75 7.72±0.75 1 d 14.80±1.70 9.08±0.70 4 d 18.23±1.801) 11.12±0.802)7 d 26.51±1.841) 13.37±0.781)14 d 19.54±1.771) 11.48±0.722)21 d 12.80±1.78 8.01±0.74

3 討論

MMPs是一類結(jié)構(gòu)高度同源的依賴性蛋白水解酶，具有選擇底物高度專一的特點，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞周圍的微環(huán)境，包括蛋白聚糖、層粘連蛋白、膠原蛋白、非膠原蛋白、纖連蛋白，明膠和纖維狀膠原〔4〕。TIMPs為MMPs的特異性抑制因子，具有特殊的結(jié)構(gòu)組成，其 C-端結(jié)構(gòu)域具有親基質(zhì)金屬蛋白酶及其亞細(xì)胞定位功能并激活蛋白質(zhì)，N-末端結(jié)構(gòu)域抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的生物學(xué)活性。MMP-2的氨基基團(tuán)與TIMP-2的N-末端的半胱氨酸殘基中的羰基的共同作用，螯合Zn2+的催化結(jié)構(gòu)域，來降低基質(zhì)金屬蛋白酶活性。正常情況下，MMPs和TIMPs協(xié)同產(chǎn)生，協(xié)調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解，以保持人體結(jié)構(gòu)和功能的完整。二者的調(diào)節(jié)平衡在創(chuàng)傷修復(fù)、組織重建、新生血管、惡性腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程中起著重要的作用〔5〕。

Haerian等〔6〕報道組織中的 TIMPs以 1∶1分子與 MMPs特異性結(jié)合，抑制MMPs的活性，在基質(zhì)合成與降解平衡中起調(diào)控作用。李永明等〔7〕研究證實:基質(zhì)的分解是MMPs和TIMPs共同參與的結(jié)果，隨著MMPs的表達(dá)增加，TIMPs也會隨之增加，防止組織被過度降解。Meikle等〔8〕運(yùn)用免疫熒光技術(shù)研究了MMPs及TIMP-1在慢性牙周炎組織中的分布，其結(jié)果為兩者都同時出現(xiàn)在組織重建活躍部位的結(jié)締組織細(xì)胞中，并且認(rèn)為MMPs、TIMPs與牙周炎的病理過程密切相關(guān)。本實驗結(jié)果證明牙周組織在生理狀態(tài)下改建處于平衡狀態(tài)，在適度的機(jī)械力作用下組織改建動態(tài)平衡被打破，機(jī)體發(fā)生自身調(diào)節(jié)，過多的MMP-2可能激活潛在的TIMP-2基因，引起TIMP-2的表達(dá)，從而達(dá)到MMP-2、TIMP-2之間的平衡，防止ECM的過度降解，保證牙周組織的正常改建，實驗驗證了二者參與了正畸牙齒移動過程中牙周組織的改建，改建重塑過程中，MMP-2降解細(xì)胞外基質(zhì)，而其活性受到 TIMP-2抑制，該研究結(jié)論和 Melissa等〔9〕的結(jié)論一致。

MMP-2在牙周組織改建中具有降解變性Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型膠原明膠的特異能力，對早期清除膠原組織起重要作用。在加力后1、4 d MMP-2濃度增高，可能正是MMP-2的形成活躍階段，在7 d以后出現(xiàn)下降，可能基質(zhì)降解開始啟動，出現(xiàn)了MMP-2的消耗，以及 TIMP-2對 MM-2的抑制作用，因此在加力后7 d MMP-2的表達(dá)出現(xiàn)下降。第14天牙槽骨中的MMP-2濃度仍處于較高濃度，提示持續(xù)2 w后牙周組織仍在積極重塑改建。至21 d時，隨牙齒移動，力值衰減，機(jī)械力的誘導(dǎo)逐漸減弱，直至牙周組織恢復(fù)到生理狀態(tài)下，MMP-2與TIMP-2恢復(fù)動態(tài)平衡，從而使其正常的生理功能得以維持，維持組織結(jié)構(gòu)的完整和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。

本實驗結(jié)果證實50 g正畸力是移動大鼠磨牙的適宜力，溫和而持久的矯治力作用于牙齒后，牙周膜產(chǎn)生代謝改變，牙周組織重塑改建，壓力側(cè)牙槽骨骨吸收，張力側(cè)牙槽骨骨增生，實現(xiàn)牙齒的有效移動。

1 Porffit WR.The evolution of orthodontics to a data-based specialty〔J〕.Am J Orthod Dentofacial Orthop，2000;117(5):545-7.

2 Rossa Jr C，Liu M，Patil C，et al.MKK3/6-p38 MAPK negatively regulates murine MMP-13 gene expression induced by IL-1beta and TNF-alpha in immortalized periodontal ligament fibroblasts〔J〕.Matrix Biol，2005;24(7):478-883.

3 Meikle MC，Hembry RM，Holley J，et al.Immunolocalization of matrix metalloproteinases and TIMP-1(tissue inhibitor of metalloproteinases)in human gingival tissues from periodontitis patients〔J〕.J Periodont Res，1994;29(1):118.

4 Gomis Ruth FX.Catalytic domain architecture of metzincin metalloproteases〔J〕.J Biol Chem，2009;284:15353-7.

5 Chaudhary AK，Singh M，Bharti AC，et al.Genetic polymorphisms of matrix metalloproteinases and their inhibitors in potentially malignant and malignant lesions of the head and neck〔J〕.J Biomed Sci，2010;17(1):10.

6 Haerian A，Adonogianaki E，Mooney J，et al.Effects of treatment on gingival crevicular collagenases，stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinase and their ability to predict response to treatment〔J〕.J Clin Periodontol，1996;23(2):83-91.

7 李永明，林 珠，馮 雪，等.MMP-3和TIMP-1在正畸牙周組織改建過程中的表達(dá)〔J〕.實用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000;16(6):417-9.

8 Meikle MC，Hembry RM，Holley J，et al.Immunolocalization of matrix metalloproteinases and TIMP-(tissue inhibitor of metalloproteinases)in human gingiva tissues from periodontitis patients〔J〕.J Periodont Res，1994;29(1):118.

9 Grant M，Wilson J，Rock P.Induction of cytokines，MMP9，TIMPs，RANKL and OPG during orthodontic tooth movement〔J〕.Eur J Orthod，2012.〔Epub ahead of print〕