經(jīng)皮自體移植濃縮骨髓干細(xì)胞治療骨不連的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究

劉亞云 楊保華 陳光連

骨不連是骨科治療中較常見并發(fā)癥，發(fā)生率大約為5%～10%［1］。重新內(nèi)固定術(shù)和各種植骨術(shù)等傳統(tǒng)治療方法，雖可使多數(shù)骨不連獲得連接。但因后期手術(shù)創(chuàng)傷及可能出現(xiàn)的并發(fā)癥使之成為骨科難癥。近年來，隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，利用骨髓干細(xì)胞的分化成骨潛能，為微創(chuàng)治療骨不連提供了條件［2］。通過直接在骨不連部位移植成骨母細(xì)胞，提高細(xì)胞募集階段的質(zhì)與量，加速骨折的愈合過程的實(shí)驗(yàn)研究，為臨床治療骨不連提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨不連模型的制作 選用兔齡5～6個(gè)月清潔級(jí)(二級(jí))雌性南昌大白兔32只，體重2.5～3.2 kg，隨機(jī)分為A、B兩組分別為實(shí)驗(yàn)組(干細(xì)胞組)及對(duì)照組(內(nèi)固定植骨術(shù))。全麻后，無菌操作下在“切除截骨骨不連模型”的基礎(chǔ)上改進(jìn)，制作一側(cè)橈骨骨損1.0 cm(包骨膜)骨不連模型。

1.2 兔橈骨骨不連治療實(shí)驗(yàn)

1.2.1 干細(xì)胞組 經(jīng)X線檢查確定骨缺損模型成功。兔子無菌麻醉下，用含抗凝劑(肝素)無菌注射器，于髂后嵴隆起處刺入髂骨達(dá)骨松質(zhì)，抽吸骨髓，在同一深度抽取最大量骨髓(l ml)后。更換穿刺點(diǎn)繼續(xù)抽吸，但兩個(gè)穿刺點(diǎn)必須有1 cm左右的間隔，共抽吸約6 ml骨髓液。這些骨髓抽吸液在細(xì)胞分離器下離心5 min獲取一濃縮的淡黃層約1 ml(即1000 /cm3以上母細(xì)胞外和一些單核細(xì)胞等)。將制作好的自體濃縮骨髓母細(xì)胞，用5 ml注射器在透視下注射到骨不連斷端處約4 mm深，針尖輕輕剝離，創(chuàng)造容納空間，將骨髓緩慢注入。取出時(shí)邊退邊做輕度的前后抽動(dòng)，使穿刺通道被周圍組織充填，同時(shí)以棉簽壓迫進(jìn)針處10 min，未見明顯液體流出。

1.2.2 內(nèi)固定植骨術(shù)組 兔子無菌麻醉下，經(jīng)手術(shù)切開暴露骨折端，咬除局部骨痂及兩端的硬化骨，打通髓腔，應(yīng)用鋼板固定，從自身髂骨取松質(zhì)骨適量，制成顆粒骨植于骨折端周圍。

1.3 觀察指標(biāo) ①觀察術(shù)后兔的活動(dòng)及傷口愈合情況;②分別于術(shù)后8、12周，每組每次隨機(jī)選取8只兔麻醉后拍攝前后位及側(cè)位X線片(投照統(tǒng)一條件為電壓40kV、電流50 mA、曝光時(shí)間0．2s、距離為60 cm)。然后耳緣靜脈注入空氣處死，先肉眼觀察骨痂生長(zhǎng)情況，再行HE染色組織學(xué)觀察，參照Lane-Sandhu X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各組骨不連愈合情況進(jìn)行評(píng)分。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，兩組間計(jì)量資料用(±s)表示，比較采用t檢驗(yàn)。設(shè)定P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般觀察結(jié)果 大體觀察所有動(dòng)物都能耐受麻醉和手術(shù)，術(shù)后動(dòng)物無1例死亡。術(shù)后第l天進(jìn)食較少，活動(dòng)也少。第2天開始基本恢復(fù)正常，手術(shù)切口無紅腫及滲液等，一期愈合，皮膚縫線自行脫落。

2.2 放射學(xué)檢查 A組術(shù)后8周骨不連間隙基本消失，連續(xù)骨小梁存在并已通過骨不連間隙;術(shù)后12周骨痂已基本完成骨化，骨外形接近正常骨形態(tài)，部分髓腔再通，靠近尺骨部分密度尤其高。B組術(shù)后8周骨痂多且呈梭型包繞骨不連間隙，貼近鋼板側(cè)的骨不連先愈合，骨髓腔基本通暢，但骨紋理較亂;術(shù)后12周骨不連間隙骨性連接，骨紋理出現(xiàn)較規(guī)律的縱向排列，髓腔再通。12周A、B組骨不連愈合的Lane-Sandhu放射學(xué)評(píng)分分別為(10.27±1.10)、(9.96±0.83)分，兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 組織學(xué)切片觀察結(jié)果 第8周A組可見大量編織骨樣組織，可見軟骨及骨演化交接區(qū)，可見較多成骨細(xì)胞，排列較整齊，部分哈弗氏管重建，骨結(jié)構(gòu)接近正常形態(tài)，局部仍可見軟骨細(xì)胞集落樣增生，仍可見骨質(zhì)未全部連接，局部有纖維組織;B組成熟骨組織較多，有少許軟骨基質(zhì)填充。第12周A組骨缺損完全修復(fù)，成熟骨小梁形成，骨髓腔已貫通，哈佛氏系統(tǒng)形成，骨小梁排列正常，結(jié)構(gòu)完全恢復(fù);B組可見大量編織骨樣組織，骨形態(tài)有序，可見大量成骨細(xì)胞，肉芽組織較少。兩組Lane-Sandhu組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分比較見表1。

表1 兩組Lane-Sandhu組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分比較(分，±s)

表1 兩組Lane-Sandhu組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分比較(分，±s)

注:各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)

組別 第8周 第12周A組16 14.20±0.63 16.35±1.21 B組16 14.35±1.20 18.20±1.20 n

3 討論

3.1 骨不連的傳統(tǒng)治療方法 骨折的正常愈合過程終止被稱為骨不連，美國食品與藥品管理(FDA)將“損傷和骨折后至少9個(gè)月，并且沒有進(jìn)一步愈合傾向已有3個(gè)月，稱為骨不連”［3］。目前，骨不連的治療可分為開放與閉合治療。開放手術(shù)治愈率達(dá)90%，療效確切，并且可以盡早恢復(fù)肢體功能，提高生活質(zhì)量，因此是治療的金標(biāo)準(zhǔn)［4］。其治療方法包括切開植骨加內(nèi)固定等，自體骨因兼有骨誘導(dǎo)活性和骨傳導(dǎo)作用且攜有成骨作用的骨髓細(xì)胞，因而成骨效果好。但自體骨來源有限，不能滿足臨床需要，特別是供骨區(qū)的疼痛、畸形無法完全避免，尤其不適用于兒童及年老體弱者。而且需切開供、受骨區(qū)的軟組織，創(chuàng)傷大，存在取材區(qū)域受限、供區(qū)并發(fā)癥多、開放植入導(dǎo)致組織創(chuàng)傷使骨折端的血運(yùn)進(jìn)一步破壞及需要二次取出內(nèi)固定物等缺點(diǎn)。尤其是當(dāng)骨不連部位組織條件差，不具備切開植骨條件時(shí)，治療將更加困難。

3.2 經(jīng)皮自體移植濃縮骨髓干細(xì)胞 骨不連時(shí)患者骨折斷端成骨細(xì)胞數(shù)量較少且活性較低，因此有必要局部補(bǔ)充具有成骨能力的種子細(xì)胞［5］。移植自體骨髓干細(xì)胞能夠利用其向成骨細(xì)胞分化促進(jìn)骨不連的愈合。問題主要是骨髓干細(xì)胞含量過低，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量很少。Hernigou在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)移植的骨髓干細(xì)胞治療骨不連的有效性與移植骨髓中母細(xì)胞的濃度、數(shù)量有關(guān)，而且提示在進(jìn)行骨髓注射治療時(shí)將母細(xì)胞濃度控制在1000/cm3以上是很有必要的。本實(shí)驗(yàn)通過移植濃度相對(duì)較高的骨髓干細(xì)胞治療的16例骨不連動(dòng)物均達(dá)到影像學(xué)及組織學(xué)骨折愈合標(biāo)準(zhǔn)。

本研究的結(jié)果提示兩組術(shù)后8周、12周X線測(cè)定、組織病理切片均形成骨性連接，新骨形成、骨改建及骨髓成熟度指標(biāo)相當(dāng)，即兩組效果相當(dāng)。而自體骨髓移植具有以下特點(diǎn):①來源豐富，無排斥反應(yīng);②操作簡(jiǎn)單、安全，大多數(shù)患者不需住院，減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)及心理負(fù)擔(dān);③創(chuàng)傷小，痛苦少，可以反復(fù)治療;④尤其對(duì)于局部軟組織條件差，不宜再次手術(shù)患者。從某種意義上講，經(jīng)皮自體移植濃縮CFU-F治療骨不連可以替代開放的植骨術(shù)，或者是開放植骨術(shù)后出現(xiàn)骨折延遲愈合及不愈合時(shí)的補(bǔ)充治療措施。

［1］ 常玉立，孫天勝．骨不連的研究現(xiàn)狀及展望．中國康復(fù)理論與實(shí)踐，2007(13):450-453.

［2］ 王廷華，李力燕，Mcdonald JM．干細(xì)胞理論與技術(shù)．第2版．北京:科學(xué)出版社，2009:56-61.

［3］ T Can ale．坎貝爾骨科手術(shù)學(xué)．王巖，主譯．第11版．北京:人民軍醫(yī)出版社，2009:2768-2783.

［4］ 常玉立，劉智，孫天勝．骨不連及其干細(xì)胞移植療法的研究進(jìn)展．感染、炎癥、修復(fù)，2007，8(3):182-185.

［5］ 孫志波，楊述華，禹志宏，等．腺病毒介導(dǎo)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白基因轉(zhuǎn)移促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨化．鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，27(3):199-201.