產(chǎn)鐵載體抗鎘微生物的篩選

朱生翠，曾曉希，湯建新，魏本杰，廖 毅，鄒春城，謝成林

（湖南工業(yè)大學(xué) 綠色包裝與生物納米技術(shù)應(yīng)用重點實驗室，湖南 株洲 421007）

0 引言

隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，株洲市的工業(yè)“三廢”對環(huán)境的污染也日趨嚴重，具有代表性的清水塘工業(yè)區(qū)污染達到高峰程度，成為全國環(huán)境污染嚴重的地區(qū)之一[1]。在各類污染物中，重金屬鎘的污染較為嚴重。鎘是有毒的重金屬，不僅影響植物和動物生長，并且通過食物鏈對人類身體健康造成危害。清水塘地區(qū)的鎘污染不僅會影響附近居民的生活，而且成為下游湘潭、長沙2市飲用水源安全的重大隱患，因此，清水塘地區(qū)的鎘污染治理已刻不容緩[2]。

目前植物-微生物聯(lián)合修復(fù)是環(huán)境友好、經(jīng)濟有效的原位修復(fù)技術(shù)，是重金屬污染治理的重要手段之一。但是用于污染土壤修復(fù)的植物通常生長緩慢、生長周期長且生物量低，對生物有效性低的重金屬不易吸收，極大地影響了修復(fù)效率[3]。微生物不能直接降解重金屬，并且會受到重金屬的毒害作用，但是微生物能吸附和轉(zhuǎn)化某些重金屬，使重金屬的生物有效性增加，促進植物對重金屬的富集作用。R.A.Abou-Shanab等[4]報道根際細菌（microbacterium arabinogalactanolyticum）的促進土壤穩(wěn)定態(tài)Ni的釋放，顯著增加了超富集植物Alyssummurale根際生物有效態(tài)Ni的濃度，Alyssummurale地上部Ni的濃度增加32%。產(chǎn)鐵載體微生物對植物生長和重金屬吸收有進一步的促進作用[5]。微生物分泌的鐵載體富集的鐵元素，提高了土壤難溶鐵的溶解性，從而提高鐵的有效性，植物可以直接吸收利用，大大增加對植物的有效性，促進植物的生物量增加，此外，鐵載體也能活化Cd等重金屬，所以植物-產(chǎn)鐵載體微生物聯(lián)合體的篩選與培育是目前聯(lián)合修復(fù)技術(shù)研究的重點[6-8]。

本實驗以清水塘地區(qū)的土壤為研究對象，首先進行土壤中耐鎘微生物的篩選，再從抗鎘微生物中篩選產(chǎn)鐵載體菌，獲得可用于污染土壤生物治理的高效耐受產(chǎn)鐵載體菌種。對篩選出來的細菌和真菌分別通過染色、插片法和掃描電鏡觀察其形態(tài)特征，為植物微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤的研究及廣泛應(yīng)用提供菌種資源。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

土壤樣品采自株洲市清水塘工業(yè)區(qū)株洲冶煉廠附近土壤（采樣深度為0～20 cm），該地區(qū)屬中亞熱帶季風濕潤氣候區(qū)，年均氣溫17.5 ℃，年均降雨量1 391.9 mm，年均風速為2.2 m/s，常年主導(dǎo)風向為西北偏北風，夏季為偏南風。

1.2 培養(yǎng)基及藥品配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨的質(zhì)量濃度為10 g/L，氯化鈉的質(zhì)量濃度為5 g/L，牛肉膏的質(zhì)量濃度為5 g/L，瓊脂的質(zhì)量濃度為20 g/L，pH 7.2。

檢測平板配方：染液含濃度為l mmol/L鎘天青，0.1 mmol/L FeCl3，4 mmol/L十六烷基三甲基溴化胺（hexadecyl trimethyl ammonium bromide,CTAB），0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（每100 mL含Na2HPO4·12H2O 2.427 g，NaH2PO4.2H2O 0.590 5 g，KH2PO40.075 g，NH4C1 0.250 g，NaCl 0.125 g，使用時10倍稀釋），pH 6.8。

CAS檢測平板：每100 mL含質(zhì)量分數(shù)為20%蔗糖溶液1 mL，純牛奶10 mL，濃度為1 mmol/L CaCl2100 uL，1 mmol/L MgSO42 mL，瓊脂1.8 g，在約60 ℃時緩慢加入鹽溶液和染液各5 mL，即得檢測培養(yǎng)基。所有溶液均用去離子水配制[9-11]。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL，pH自然。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗鎘菌株的分離及純化

準確稱取采集的土樣10 g，加入90 mL加有玻璃珠的無菌水中，制成土壤懸液，于150 r/min轉(zhuǎn)速下充分振蕩10 min，待孢子分散后，靜置5 min，取上清液，采用10倍連續(xù)稀釋法將土壤懸液稀釋至10-5，選擇10-3, 10-4, 10-5這3個稀釋度，分別將土壤懸液涂布在含有濃度為1.0，1.5，2.0 mmol/L CdSO4·8H2O的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，每個稀釋度做3個平行試驗，且以不添加CdSO4·8H2O為空白試驗，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d。挑選具有生長優(yōu)勢的單個菌落重復(fù)劃線2～3次，同時鏡檢其純度，直至獲得純培養(yǎng)菌株，保存留用。

1.3.2 產(chǎn)鐵載體菌株的篩選

將純化后的抗鎘菌種采用劃線法轉(zhuǎn)接到檢測平板上，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～7 d，每12 h觀察一次結(jié)果，挑選發(fā)生變粉色反應(yīng)的菌種進行純化，保存留用。

1.3.3 菌株的形態(tài)特征

根據(jù)濡化理論和文化身份理論，理想的外語學(xué)習(xí)者應(yīng)該既對目的語文化有深入的了解，又對母語文化具有深刻的認同。

取對數(shù)期的目的細菌進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察并作記錄；將純化的真菌采用劃線法轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，在所劃線的部分插入已滅菌的蓋玻片，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～7 d。SEM（scanning electron microscope）觀察真菌的形態(tài)學(xué)特征并作記錄，分別參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《真菌鑒定手冊》進行初步鑒定[12]。

1.3.4 菌株Cd2+最低抑菌濃度的測定

菌懸液的配制：從保存3株菌的試管斜面挑出一環(huán)菌，分別接種到PDA培養(yǎng)基斜面上，待菌株長出后，添加無菌水，配成菌懸濁液，準備接種。

取1 mL菌懸液，加入49 mL不同質(zhì)量濃度的重金屬離子液體培養(yǎng)基中（重金屬質(zhì)量濃度分別為400,500, 600, 1 000, 1 200 mg/L），于28 ℃和150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)3 d后，涂平板計數(shù)[13-14]，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)鐵載體抗鎘菌株的篩選

從含鎘牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上共選出生長良好、菌落特征不同的菌株19株，其中6株細菌分別標號為X3, X15, X16, X18, X19, X22，13株真菌分別標號為Z1,Z2,Z4,Z5,Z6, Z8, Z9, Z10, Z13, Z14, Z20, Z21,Z23。將以上篩選出的19株菌種通過CAS固體檢測，其檢測結(jié)果見圖1。

圖1 菌株鐵載體檢測結(jié)果Fig.1 The detection results for siderophores strains

固體檢測培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，待測菌株都長出了明顯的單菌落，但是僅接種菌株X19, X22和Z1的固體檢測平板發(fā)生了明顯的顏色變化，X19, X22變?yōu)榉奂t色，Z1菌絲由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色，本實驗現(xiàn)象和蒙淵在鐵載體陽性菌株篩選實驗中的現(xiàn)象一致[15]。結(jié)果說明，菌株X19, X22和Z1可以分泌鐵載體，而菌株Z5（如圖1a所示）作為對照，在CAS固體檢測平板上沒有發(fā)生變色反應(yīng)，說明Z5不能分泌鐵載體。

2.2 X19, X22和Z1的初步鑒定

細菌X19, X22經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖2～3所示。

圖2 細菌X19(10×100)Fig.2 Bacterium X19(10×100)

圖3 細菌X22(10×100)Fig.3 Bacterium X22(10×100)

由圖2和3可看出，X19, X22都為革蘭氏陰性菌，菌體呈直桿狀，1.1～1.5m×2.0～6.0m，根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步鑒定X19, X22都為腸桿菌科埃希氏菌屬。

將純化的真菌插片培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～7 d后Z1菌絲呈白色，SEM觀察真菌的形態(tài)特征，Z1的掃描電鏡結(jié)果如圖4～5所示。

圖4 Z1菌絲體Fig.4 The mycelium of Z1

圖5 Z1孢子絲Fig.5 The spore hypha of Z1

由圖4可看出，Z1具有發(fā)達的菌絲體，整個菌絲體是由基內(nèi)菌絲、氣生菌絲和繁殖菌絲組成的。由圖5可看出，子囊殼有發(fā)達程度不同的包被，無孔口，子囊排列不規(guī)則，短而寬闊，子囊孢子光滑，子囊果有大型柄，氣生菌絲上產(chǎn)生簡單的長而直立的分生孢子梗，分生孢子梗長4.7～8.0m，頂端以特殊的對稱或不對稱掃帚狀分支，稱為帚狀枝，分支為多極的分生孢子梗產(chǎn)生的瓶梗，在瓶梗上有串生分生孢子，分生孢子為球形至卵形，0.6～2.5m×0.4～2.3m，根據(jù)以上形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》，初步鑒定Z1為真菌界子囊菌門散囊菌綱散囊菌目曲霉屬。

2.3 鎘離子最低抑菌濃度

最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)是指在體外實驗中，各種重金屬能抑制菌體生長的最低濃度，MIC值越大，重金屬對菌體的毒性越小；MIC值越大，菌體對重金屬的抗性就越大[13]。隨著鎘離子濃度的增大，培養(yǎng)基中菌落數(shù)呈下降趨勢。Cd2+濃度對菌落數(shù)的影響曲線如圖6所示。

圖6 鎘離子濃度對X19, X22, Z1菌落數(shù)的影響Fig.6 Effect of Cd2+ concentrations on thegrowth of X19, X22 and Z1

圖6表明：隨著Cd2+濃度的增大，3株菌存活的菌落數(shù)呈下降趨勢。重金屬質(zhì)量濃度在100～260 mg/L范圍時，對微生物的生長繁殖影響不大；質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，當達到一個臨界值時，重金屬離子對菌體產(chǎn)生較為嚴重的毒害作用，菌體的生長繁殖明顯受到抑制，菌落數(shù)急劇下降。不同菌株MIC有所不同：X19的MIC約為450 mg/L，X22約為220 mg/L，Z1的MIC最大，約為800 mg/L。

3 討論

微生物通過吸附和轉(zhuǎn)化某些重金屬，使重金屬的生物有效性增加，微生物吸附重金屬離子的機理十分復(fù)雜，按是否消耗能量分為活細胞吸附及死細胞吸附兩種。革蘭氏陽性細菌的細胞壁中含有較多的磷壁酸，帶有較強的負電荷，能吸附陽離子[16]。微生物通過氧化-還原作用或烷基取代作用等轉(zhuǎn)化重金屬，使重金屬從一種形態(tài)轉(zhuǎn)化為另一種形態(tài)，如嗜酸鐵氧化細菌能夠氧化Fe2+、還原態(tài)的S和金屬硫化物來獲得能源，影響重金屬的活動性。不同的微生物活細胞內(nèi)積累重金屬離子的能力存在很大差異，過量的重金屬離子對微生物的生長也會產(chǎn)生毒害作用[17]。因此，經(jīng)抗鎘試驗中篩選出了19種積累重金屬優(yōu)勢菌株。

鐵載體是由生活在開放環(huán)境中的好氧和兼性好氧微生物為適應(yīng)地球地殼高氧低鐵環(huán)境下生長代謝的需要而產(chǎn)生的一種高鐵離子鰲合劑。它能夠與四價的錒系元素形成穩(wěn)定的化合物，鐵載體還能影響其它金屬如銅、鋅、鈣和鉛在土壤中的運動性[18]。微生物分泌的鐵載體能富集鐵元素，提高土壤難溶鐵的溶解性，從而提高鐵的有效性，增加植物的有效性，促進植物生物量的增加[19]。

CAS平板檢測法可以用于大多數(shù)細菌和真菌分泌的鐵載體檢測，適合于初步篩選產(chǎn)鐵載體的菌株，該檢測方法比較簡單、方便。本研究從19種抗鎘微生物中篩選到2株產(chǎn)鐵載體菌株，依據(jù)變色程度初步斷定產(chǎn)鐵載體能力為X19>X22>Z1。對抗鎘和產(chǎn)鐵載體篩選試驗獲得的X19, X22和Z1進行初步鑒定，X19,X22都為腸桿菌科埃希氏菌屬，Z1為真菌界子囊菌門散囊菌綱散囊菌目曲霉屬。

本研究分離到的菌株X19, X22和Z1對鎘有較強的耐抗性，在MIC實驗中，Z1對鎘的耐抗性高達1 000 mg/L，表明其在以鎘污染為主的土壤微生物修復(fù)中具有巨大的潛在價值，但對其作用機理和絕對抗鎘能力和目的菌種的鑒定還有待進一步研究，以期為植物-微生物聯(lián)合修復(fù)提供可能的高效菌種資源。

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