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    不同保存溫度對布氏菌病活疫苗(S2株)細(xì)菌存活的影響

    2013-09-17 08:50:30張讀樸彭飛烏斯?jié)M江黃炯張玉紅劉淑梅趙海源王洪巧
    獸醫(yī)導(dǎo)刊 2013年12期
    關(guān)鍵詞:布氏活菌菌液

    張讀樸,彭飛,烏斯?jié)M江,黃炯,2,張玉紅,劉淑梅,趙海源,王洪巧

    (新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司 新疆烏魯木齊 830032;2 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 新疆烏魯木齊 830000)

    不同保存溫度對布氏菌病活疫苗(S2株)細(xì)菌存活的影響

    張讀樸1,彭飛1,烏斯?jié)M江1,黃炯1,2,張玉紅1,劉淑梅1,趙海源1,王洪巧1

    (新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司 新疆烏魯木齊 830032;2 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所 新疆烏魯木齊 830000)

    《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》規(guī)定布氏菌病活疫苗貯藏條件為2℃~8℃,有效期為一年。但在疫苗檢驗(yàn)過程中,發(fā)現(xiàn)保存在2℃~8℃條件下的布氏菌病活疫苗活菌數(shù)下降的幅度較大,造成活菌數(shù)時(shí)有不達(dá)標(biāo)的情況。為了保證疫苗在一年有效期內(nèi)的活菌數(shù)量,常常采用增大附加量(計(jì)算頭份時(shí)一般不少于30%的附加量)或低溫冷凍條件保存(-15℃以下)的方法。考慮到疫苗的安全性和成本,增大附加量并不是可采用的好方法,低溫存放卻易于做到。為了驗(yàn)證2℃~8℃保存和-15℃以下低溫冷凍保存的效果,本研究對比了3批布氏菌病活疫苗(S2株)在不同溫度條件保存對細(xì)菌存活的影響。

    一、材料與方法

    1.疫苗。本公司生產(chǎn)的布氏菌病活疫苗(S2株),批號分別為2010004批、2012006批和2012007批。

    2.培養(yǎng)基。胰蛋白眎瓊脂平板、蛋白胨水。

    3.試驗(yàn)方法。以保存1月為周期,每批取2℃~8℃和-15℃保存的疫苗各3瓶,每瓶加適量蛋白胨水充分溶解均勻,然后用蛋白胨水10倍系列稀釋至10-9,取0.1ml滴胰蛋白眎瓊脂平板3個(gè),37℃培養(yǎng)72~96 h數(shù)平板上的菌落數(shù),3個(gè)平板上菌落數(shù)相加除以3乘以疫苗瓶加量(ml)即為每瓶活菌數(shù)(CFU)。3瓶活菌數(shù)(CFU)平均即為當(dāng)月保存后的細(xì)菌活菌數(shù)(CFU)。疫苗剛生產(chǎn)出活菌計(jì)數(shù)所得活菌數(shù)(CFU)即0個(gè)月為計(jì)算活菌率的基數(shù),計(jì)算細(xì)菌存活率。

    4.統(tǒng)計(jì)分析。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Prism 5.0,對同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗(S2株)的菌存率進(jìn)行配對數(shù)據(jù)的t檢驗(yàn),對同一保存溫度不同批次布氏菌病活疫苗(S2株)的菌存率進(jìn)行單因素方差分析和Tukey's 多重比較。

    二、結(jié)果

    1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過對3批布氏菌病活疫苗(S2株)分別保存在2℃~8℃和-15℃的疫苗1年12次的活菌計(jì)數(shù)檢測,顯示在2℃~8℃條件下保存的疫苗,3批疫苗從第3個(gè)月起,活細(xì)菌數(shù)均明顯下降,存活率在57.9~69.6%之間;至第12個(gè)月時(shí)存活率已經(jīng)降至約36.37~48.18%之間。在-15℃以下條件保存的疫苗,在12個(gè)月的檢測過程中,只有2010004批細(xì)菌存活率最低,為60.29%,2012006批在80%以上,2012007批在75%以上。各批細(xì)菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見表略,存活率變化情況見圖1。

    2.統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件Prism 5.0,對同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗(S2株)的菌存率,以及對同一保存溫度不同批次疫苗的菌存率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    三、討論

    由計(jì)數(shù)結(jié)果和折線圖可見,2℃~8℃和-15℃保存的3批布氏菌病活疫苗(S2株),活菌率后者均明顯優(yōu)于前者。2010004批疫苗保存1年后菌存率2~8℃為36.27%,-15℃為60.29%,2℃~8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著(P <0.01),且后者比前者高24.02%;2012006批疫苗保存1年后菌存率2℃~8℃為44.63%,-15℃為84.36%,2℃~8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著(P<0.01),且后者比前者高39.73%;2012007批疫苗保存1年后菌存率2℃~8℃為48.18%,-15℃為89.63%,2℃~8℃與-15℃保存的活菌率差異性極顯著(P<0.01),且后者比前者高41.45%。通過對比分析顯示,三批布氏菌病活疫苗(S2株)的活菌率2℃~8℃保存的與-15℃保存的活菌率差異性極顯著(P <0.01)。

    2012006、2012007兩 批疫苗在1年的菌存率檢測中均比2010004批疫苗高,其中,2010004批疫苗2℃~8℃保存的菌存率與2012006批疫苗差異性顯著(P< 0.05),與 2012007批疫苗差異性極顯著(P<0.01);2010004批疫苗-15℃保存的菌存率與2012006、2012007批疫苗均差異性極顯著(P<0.01)。出現(xiàn)這種情況,可能是制造疫苗的批間差異,前兩批疫苗的菌液收獲時(shí)機(jī)比較合適,細(xì)菌處于生長的對數(shù)期或穩(wěn)定前期階段,細(xì)菌比較健壯(幼齡和老齡都極易死亡)。掌握好菌液收獲時(shí)間很重要,既要收獲的細(xì)菌活力好,又要活菌數(shù)高。在生物制品生產(chǎn)過程中,一般在對數(shù)生長期收獲菌液。細(xì)菌的形態(tài)、革蘭氏染色反應(yīng)應(yīng)以對數(shù)生長期到靜止期中期的細(xì)菌為標(biāo)準(zhǔn)。

    有文章報(bào)道,布魯氏菌病活疫苗(S2株)在2℃~8℃保存一年活菌率為78.5~82.3%。 布魯氏菌病活疫苗(S19株)保存一年活菌率為82.54~82.64%。本次試驗(yàn)證實(shí)布氏菌病活疫苗(S2株)在2℃~8℃保存一年活菌率僅為36.27%~48.18%,遠(yuǎn)低于報(bào)道的78.5~82.3%的水平。

    以往通氣生產(chǎn)布氏菌病活疫苗的收獲菌液活菌數(shù)只有幾百億CFU/ml,個(gè)別的能達(dá)到1000億CFU以上/ml,牛種更低一些。隨著技術(shù)的進(jìn)步,設(shè)備裝備水平的提高,培養(yǎng)基質(zhì)量的改進(jìn),生產(chǎn)人員經(jīng)驗(yàn)的積累,反應(yīng)罐布氏菌病活疫苗(S2株)菌液通氣生產(chǎn)細(xì)菌增殖水平顯著提高,據(jù)筆者粗略統(tǒng)計(jì),本公司2010年度生產(chǎn)的37批布氏菌病活疫苗(S2株)菌液活菌數(shù)平均為717億CFU/ml;2011年度49批活菌數(shù)平均為1328億CFU/ml;2012年度9批活菌數(shù)平均為1164億CFU/ml。細(xì)菌生長的好,繁殖的快有時(shí)也會死亡的快,筆者在做牛出敗疫苗檢驗(yàn)時(shí),發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)菌種的培養(yǎng)基中添加血清時(shí),細(xì)菌生長的好,活菌數(shù)也很高,但存放一定時(shí)間后細(xì)菌死亡的很快。布氏菌病活疫苗(S2株)是否也有這方面的原因,還需證實(shí)。

    圖1 三批布氏菌病活疫苗(S2株)不同保存溫度菌存率

    表2 同一批次不同保存溫度布氏菌病活疫苗(S2株)菌存率的比較分析

    表3 同一保存溫度不同批次布氏菌病活疫苗(S2株)菌存率的比較分析

    影響疫苗質(zhì)量的因素很多,如細(xì)菌種子的質(zhì)量、培養(yǎng)基的質(zhì)量、培養(yǎng)溫度、菌液培養(yǎng)時(shí)加糖量的多少、通氣量的大小、培養(yǎng)過程PH值的變化、菌液收獲時(shí)間、菌液存放時(shí)間、保護(hù)劑質(zhì)量、凍干曲線等,哪個(gè)環(huán)節(jié)有問題都會對產(chǎn)品造成影響。各個(gè)工序都應(yīng)該認(rèn)真研究總結(jié),探索最佳條件,以期生產(chǎn)出質(zhì)量過硬的產(chǎn)品。

    根據(jù)細(xì)菌存活的生物學(xué)特性,低溫可以延緩微生物死亡,例如牛瘟兔化弱毒疫苗的新鮮淋脾毒在0℃~4℃只能保存14 d,而在-10℃~-15℃就可保存3個(gè)月;豬瘟兔化弱毒疫苗的新鮮脾淋在0℃~4℃只能保存14 d,而在-15℃則可保存6個(gè)月。本次研究結(jié)果也證實(shí):-15℃保存明顯優(yōu)于2℃~8℃保存,-15℃保存對保證產(chǎn)品質(zhì)量起著非常重要的作用,建議修改布氏菌病活疫苗貯藏的規(guī)定,將2℃~8℃貯藏調(diào)整為-15℃以下貯藏。

    (略)

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