Sorcin蛋白高表達(dá)與肺癌細(xì)胞株NCI-H446多藥耐藥的關(guān)系

王 濤，裴復(fù)陽，王 琪，王鶯燕

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116027;3.大連醫(yī)科大學(xué) 診斷教研室，遼寧大連 116044)

Sorcin蛋白高表達(dá)與肺癌細(xì)胞株NCI-H446多藥耐藥的關(guān)系

王 濤1，裴復(fù)陽1，王 琪2，王鶯燕3

(1.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116001;2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，遼寧 大連 116027;3.大連醫(yī)科大學(xué) 診斷教研室，遼寧大連 116044)

目的 探討Sorcin高表達(dá)與肺癌細(xì)胞NCI-H446多藥耐藥的相關(guān)性。方法 研究對(duì)象為肺癌細(xì)胞NCI-H446，以順鉑為誘導(dǎo)藥物，建立多藥耐藥細(xì)胞系NCI-H446/CDDP;應(yīng)用反義核酸技術(shù)抑制NCI-H446/CDDP細(xì)胞Sorcin的表達(dá)建立轉(zhuǎn)染細(xì)胞，為反義核酸組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。通過RT-PCR及Western-blot分別檢測(cè)各組細(xì)胞中Sorcin在核酸及蛋白水平的表達(dá);MTT法測(cè)定NCI-H446組、反義核酸組、NCI-H446/CDDP組3組細(xì)胞在不同化療藥物DDP、VCR、ADM、VP-16作用下生存率;用Pearson相關(guān)分析Sorcin高表達(dá)與肺癌細(xì)胞株NCI-H446多藥耐藥的相關(guān)性。結(jié)果 各組細(xì)胞中Sorcin在核酸及蛋白水平的表達(dá)，NCI-H446/CDDP組與空白對(duì)照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05)，NCI-H446組、反義核酸組、NCI-H446/CDDP組各組間比較均具有顯著性意義(P＜0.05);NCI-H446/CDDP細(xì)胞中Sorcin在核酸及蛋白水平均明顯高于NCI-H446細(xì)胞，分別為NCI-H446細(xì)胞的9.81倍和7.67倍。各組細(xì)胞在不同化療藥物作用下IC50:NCI-H446/CDDP組＞反義核酸組＞NCI-H446組，各組間比較差異具有顯著性意義(P＜0.05)。Pearson相關(guān)提示:Sorcin核酸及蛋白水平的表達(dá)與在不同化療藥物作用下各組細(xì)胞的IC50值呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論 Sorcin蛋白的高表達(dá)與肺癌多藥耐藥相關(guān)，抑制Sorcin蛋白的表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)肺癌多藥耐藥性。

可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白;肺癌;多藥耐藥;耐藥指數(shù)

腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥性(multi-drug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞接觸一種化療藥物并對(duì)其產(chǎn)生耐藥后，同時(shí)對(duì)其他化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物亦產(chǎn)生耐藥［1］。肺癌是全球性的惡性疾病，其發(fā)病及死亡率在世界范圍的腫瘤性疾病中居首位，化療是肺癌的主要治療方法，但是肺癌對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥常常導(dǎo)致治療失?。?］。肺癌耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，因此迫切需要探明耐藥機(jī)制，通過各種途徑逆轉(zhuǎn)其耐藥性。很多研究表明，可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白 (Sorcin)是一種胞漿蛋白，與腫瘤的多藥耐藥關(guān)系非常密切，目前對(duì)其研究主要集中在胃癌與血液系統(tǒng)腫瘤方面［3-4］，對(duì)其與肺癌多藥耐藥關(guān)系的研究頗少。本研究旨在通過RT-PCR及Western-blot分別檢測(cè)NCI-H446細(xì)胞及多藥耐藥細(xì)胞NCI-H446/CDDP中Sorcin在核酸及蛋白水平的表達(dá)水平，觀察應(yīng)用反義核酸技術(shù)抑制NCI-H446/CDDP細(xì)胞Sorcin的表達(dá)后耐藥情況的變化，探討Sorcin在肺癌細(xì)胞多藥耐藥中的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象及試劑

人小細(xì)胞肺癌(SCLC)細(xì)胞株NCI-H446購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫。RPMI 1640培養(yǎng)基、優(yōu)等胎牛血清和精制小牛血清(Hyclone產(chǎn)品);二甲基四氮唑蘭(MTT)(Bebco公司產(chǎn)品);二甲基亞砜(DMSO)、DDP、5-FU、VCR、ADM 和 VP -16(Sigma公司產(chǎn)品);RT-PCR試劑盒、DNA Marker DL2000(Takara產(chǎn)品)，羊抗人Sorcin一抗抗體、羊抗人βactin抗體、HRP-兔抗羊IgG(Santa Cruz公司)。

1.2 方 法

1.2.1 多藥耐藥細(xì)胞系NCI-H446/CDDP的誘導(dǎo)建立:以人SCLC細(xì)胞株NCI-H446為誘導(dǎo)對(duì)象，順鉑為誘導(dǎo)藥物，采用首次大劑量沖擊和逐步增加劑量結(jié)合的方式，最終建立人SCLC多藥耐藥細(xì)胞系NCI-H446/CDDP。該耐藥細(xì)胞系能在含有0.5 μg/mL順鉑的RPMI1640培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長(zhǎng)和傳代。

1.2.2 Sorcin 反義核苷酸轉(zhuǎn)染 NCI- H446/CDDP細(xì)胞:采用Sorcin反義核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASO)抑制Sorcin在NCI-H446/CDDP的表達(dá)。反義核酸序列參照文獻(xiàn)［6］，反義核酸序列為5’-TACGCCATGCTGCAGACTGC-3’與 Sorcin翻譯起始區(qū)互補(bǔ)。反義核酸序列經(jīng)GenBank比對(duì)，與已知任何哺乳動(dòng)物基因無匹配。硫代修飾的Sorcin反義核酸由TaKaRa公司合成。按脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine2000)說明轉(zhuǎn)染反義核酸至 NCIH446/CDDP細(xì)胞。并設(shè)脂質(zhì)體(oligofect-amine)為空白對(duì)照組。

1.2.3 細(xì)胞分組:將細(xì)胞分為4組:NCI-H446組、反義核酸組、空白對(duì)照組、NCI-H446/CDDP組。

1.2.4 RNA提取以及RT-PCR:按試劑盒說明分別提取各組細(xì)胞的總RNA，制備cDNA，進(jìn)行PCR產(chǎn)物擴(kuò)增。Sorcin引物由上海生工公司合成。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［3］，上游引物:5’AAAAGATCTATGGCGTACCGGGGCAT 3’;下游引物:5’GGGTCTAGATTAAACA CTCATGACACATTG 3’;內(nèi)參β-actin上游引物序列為5’CTACAATGAGCTGCGTGTGGC 3’，下游引物序列為 5’GAGGTCCAGACGCAGGATGGC 3’。取 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，用美國(guó)UVP凝膠成像系統(tǒng)EC3System進(jìn)行掃描分析，計(jì)算公式為:某樣品Sorcin mRNA的相對(duì)表達(dá)水平=樣品Sorcin的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.5 蛋白提取及Western雜交:將細(xì)胞置于1.5 mL Eppendorf管中，加入 RIPA 緩沖液 300 μL，以12 000 r/min速度、4℃離心10 min，將上清轉(zhuǎn)移至新管，再重復(fù)離心2次，-70℃保存;使用Bradford比色法測(cè)定蛋白含量，依次進(jìn)行SDS-PAGE、電轉(zhuǎn)印。取下轉(zhuǎn)印好的PVDF膜，放入封閉液中4℃封閉過夜，加入稀釋的羊抗人Sorcin一抗抗體(一抗，1∶200)及羊抗人 β -actin(一抗，1∶400)，37℃孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次。再加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG(二抗，1∶5 000)，37℃孵育1 h，PBST洗膜3次，5 min/次，在室溫進(jìn)行ECL顯色。用美國(guó)UVP公司EC3 System凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描分析，計(jì)算公式為:樣品Sorcin蛋白的相對(duì)表達(dá)水平=樣品Sorcin的IOD值/樣品β-actin的IOD值。

1.2.6 體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn):采用 MTT法檢測(cè)NCI-H446組、反義核酸組、NCI-H446/CDDP組細(xì)胞對(duì)DDP、VCR、ADM和VP-16的藥物敏感性。將細(xì)胞以1×105/mL的濃度接種于96孔培養(yǎng)板，200 μL/孔，培養(yǎng)24 h后加入生理鹽水稀釋的不同濃度的各種化療藥物，共同作用24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，再培養(yǎng)4 h后，離心去除培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜 150 μL，用震蕩器震蕩10 min，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上選擇波長(zhǎng)570 nm測(cè)定吸光值(A值)，比色時(shí)空白孔調(diào)零，全部實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)A值計(jì)算細(xì)胞存活率(vitalrate，VR)，計(jì)算公式為:細(xì)胞存活率(%)=用藥組A值/對(duì)照組A值×100%。根據(jù)各藥物VR，由藥物濃度的對(duì)數(shù)值與VR線性回歸求出各藥物的半數(shù)抑制率(IC50)。計(jì)算耐藥指數(shù)(resistant index，RI)，RI=IC50實(shí)驗(yàn)組/IC50對(duì)照組［5］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用MEAN±SD表示，采用 SPSS 12.0軟件處理，用單向方差分析比較多組間均數(shù)的差異，用Pearson相關(guān)分析Sorcin高表達(dá)與肺癌細(xì)胞株NCI-H446多藥耐藥的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sorcin核酸水平的表達(dá)

RT-PCR結(jié)果顯示:各組細(xì)胞Sorcin mRNA的相對(duì)表達(dá)量如圖1所示，NCI-H446組、反義核酸組、空白對(duì)照組和NCI-H446/CDDP組的 SorcinmRNA 表達(dá)水平分別為:0.094 ±0.001、0.441 ±0.031、0.814 ± 0.036 和 0.923 ± 0.012。NCI -H446/CDDP組與空白對(duì)照組比較，差異無顯著性意義(P＞0.05);NCI-H446組、反義核酸組、NCIH446/CDDP組各組間比較差異均具有顯著性意義(P＜0.05)。NCI-H446/CDDP組及反義核酸組分別為NCI-H446組的9.81倍及4.69倍。

2.2 Sorcin蛋白水平的表達(dá)

Western-blot結(jié)果顯示如圖2:與核酸表達(dá)一樣，NCI-H446/CDDP組Sorcin蛋白的表達(dá)最高，反義核酸組次之，NCI-H446組最低，分別為:0.943±0.024、0.357 ±0.023、0.123 ±0.021，各組間比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。NCI-H446/CDDP組及反義核酸組分別為NCI-H446組的7.67倍及2.9倍?？瞻讓?duì)照組Sorcin蛋白的表達(dá)為0.874±0.017與NCI-H446/CDDP組比較，差異無顯著性意義(P ＞0.05)。

圖1 不同組細(xì)胞Sorcin核酸水平的表達(dá)Fig 1 Expression of Sorcin mRNA in different cell group

圖2 不同組細(xì)胞Sorcin蛋白水平的表達(dá)Fig 2 Expression of Sorcin protein in different cell group

2.3 各組細(xì)胞的藥物敏感性測(cè)定

MTT法檢測(cè)3組細(xì)胞:NCI-H446組、反義核酸組、NCI-H446/CDDP組在不同化療藥物DDP、5-FU、VCR、ADR和VP-16作用下的敏感性如表1。各組細(xì)胞IC50:NCI-H446/CDDP組＞反義核酸組＞NCI-H446組，各組間比較，差異均具有顯著性意義(P ＜0.05)。

表1 3組細(xì)胞在不同化療藥作用下的IC50值Tab 1 The IC50of three cell group in different chemotherapy drugs

2.4 Pearson相關(guān)

Sorcin mRNA及蛋白表達(dá)與不同化療藥物作用下各組細(xì)胞的IC50值之間呈負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，見表2。

表2 Sorcin mRNA及蛋白表達(dá)與在不同化療藥物作用下細(xì)胞IC50值之間的相關(guān)系數(shù)Tab 2 Correlation coefficient between the expression of sorcin in mRNA and protein in IC50of the group cells in different chemotherapy drugs

3 討論

肺癌已經(jīng)成為全世界最常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤相關(guān)死亡原因中占第1位?；熓欠伟┑闹饕委煼椒ǎ怯捎诜伟?duì)許多化療藥物產(chǎn)生耐藥常常導(dǎo)致化療失敗。肺癌的耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，一般可分為內(nèi)源性和獲得性耐藥。因此迫切需要探明肺癌耐藥機(jī)制，通過各種途徑逆轉(zhuǎn)其耐藥性。

腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是指腫瘤細(xì)胞對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)上無關(guān)，作用靶點(diǎn)不同、作用機(jī)制亦各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，這是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象。近年來，MDR形成機(jī)制已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)之一。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的耐藥相關(guān)蛋白有P170糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白、肺耐藥蛋白、拓?fù)洚悩?gòu)酶、蛋白激酶C、乳腺癌耐藥相關(guān)蛋白及超氧化酶歧化酶等。但以往研究結(jié)果都不能完全解釋腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象［6］。因此，有必要采用新方法和技術(shù)開展腫瘤多藥耐藥性研究。

可溶性耐藥相關(guān)鈣結(jié)合蛋白(Sorcin)是一種胞漿蛋白，具有典型的“E-F hand”鈣結(jié)合位點(diǎn)，廣泛分布于正常組織，其中心肌組織含量最為豐富［7］。1981年Meyers等［8］首次從長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的中國(guó)倉鼠多藥耐藥細(xì)胞株DC-3F/VCRd-5中發(fā)現(xiàn)了這種高表達(dá)的胞漿蛋白(PI=5.7)。研究發(fā)現(xiàn)Sorcin能在50%以上多種藥物篩選的多藥耐藥細(xì)胞中大量表達(dá)。Lee［9］建立了耐長(zhǎng)春新堿(VCR)的淋巴瘤耐藥株HOB1/VCR，Southern檢測(cè)發(fā)現(xiàn)僅在高濃度的VCR作用下才有Sorcin基因的擴(kuò)增，且Sorcin基因不隨mdr1基因的擴(kuò)增而擴(kuò)增，故認(rèn)為Sorcin基因的擴(kuò)增和mRNA的表達(dá)是在高濃度VCR作用下產(chǎn)生的，其研究結(jié)果也提示Sorcin與mdr1相關(guān)性不高，很可能在多藥耐藥性產(chǎn)生中單獨(dú)起作用。Parekh HK等［10］將Sorcin基因cDNA轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞株和乳腺癌細(xì)胞株，誘導(dǎo)出了對(duì)紫杉酚的低水平抗藥性，雖然Sorcin基因的轉(zhuǎn)染沒有誘導(dǎo)出高水平的抗藥性，但這是Sorcin參與多藥耐藥性形成的有力證據(jù)。Sorcin與腫瘤的多藥耐藥關(guān)系非常密切，目前主要集中在胃癌與血液系統(tǒng)腫瘤方面［2-3］，但是對(duì)Sorcin與肺癌多藥耐藥關(guān)系的研究頗少。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示:NCI-H446/CDDP細(xì)胞Sorcin在核酸及蛋白水平的表達(dá)明顯高于NCI-H446細(xì)胞，相應(yīng)的NCI-H446/CDDP細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的IC50值亦明顯高于NCI-H446細(xì)胞;應(yīng)用反義核酸技術(shù)抑制NCI-H446/CDDP細(xì)胞Sorcin的表達(dá)后細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的IC50值降低;Pearson相關(guān)提示:Sorcin核酸及蛋白水平的表達(dá)與在不同化療藥物作用下各組細(xì)胞的IC50值呈負(fù)相關(guān)，表明Sorcin的表達(dá)與肺癌多藥耐藥有關(guān)，抑制其表達(dá)可望成為提高肺癌化療效果的新手段。

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Relationship of Sorcin over-expression to multidrug resistance of human lung cancer cell line NCI-H446

WANG Tao1，PEI Fu -yang1，WANG Qi2，WANG Ying-yan3
(1.Department of Respiratory Medicine，Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University，Dalian116001，China;2.Department of Respiratory Medicine，the Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116027，China;3.Diagnostic Laboratory，Dalian Medical University，Dalian116044，China)

［Abstract］ObsjectiveTo investigate the relationship of the high expression of sorcin with multidrug resistance in lung cancer cell NCI-H446.MethodsLung cancer cell NCI-H446 was object of study，set up cell line NCI-H446/CDDP through cisplatin;Using antisense nucleic acid technology inhibited the expression of sorcin in NCI- H446/CDDP cell，building antisense nucleic acid group，at same time setting up blank control group.RT-PCR and Western-blot were used to analyze the expression of sorcin at mRNA and protein levels in every cell group.MTT was used to three groups cell(NCI-H446 cell group，antisense nucleic acid group，NCI-H446/CDDP group)survival rate in DDP，VCR，ADM，VP-16.Pearson correlation was used to analyze the correlation of the high expression of sorcin with multidrug resistance in lung cancer cell NCI-H446.ResultsComparison with the expression mRNA and protein of sorcin in every groups，the result showed:comparing NCI-H446/CDDP group with blank control group has no statistical significance(P＞0.05)，In-tercomparison in NCI-H446 cell group，antisense nucleic acid group，NCI-H446/CDDP group has statistical significance(P ＜0.05).The expression mRNA and protein of sorcin in NCI-H446/CDDP were obviously higher than it in NCIH446 cell，9.81 and 7.67 times respectively.The result of IC50:NCI- H446/CDDP group ＞ antisense nucleic acid group ＞ NCI-H446 cell group，has statistical significance(P ＜0.05).Pearson correlation to point out:the expression of sorcin in mRNA and protein was negatively correlated to IC50of the group cells in different chemotherapy drugs.ConclusionThe high expression of sorcin is related to multidrug resistance in lung cancer cell，Inhibition of its expression can reverse the drug resistance of lung cancer.

［Key words］soluble-resistance related calcium binding protein(sorcin);lung cancer;muit-drug resistance;resistance index

R734.2

A

1671-7295(2013)05-0420-04

王濤，裴復(fù)陽，王琪，等.Sorcin蛋白高表達(dá)與肺癌細(xì)胞株NCI-H446多藥耐藥的關(guān)系［J］.大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(5):420 -423，433.

10.11724/jdmu.2013.05.03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30670532，81071228)

王 濤(1970-)，女，山東德州人，主治醫(yī)師，碩士研究生。E-mail:wangtao9879@hotmail.com

王 琪，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail:wqdmu@yahoo.com.cn

2013-07-11;

2013-08-25)