麥苗中阿魏酸、抗壞血酸(VC)、總黃酮協(xié)同抗氧化能力分析

張志清 向建軍 周利茗 蒲 彪

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川雅安 625014)

麥苗作為一種中國傳統(tǒng)的中草藥，其功效在《本草綱目》《得配本草》《傷寒類要》等中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)典籍中都有詳細(xì)記載［1］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，麥苗有減肥、降脂、抗氧化、抗炎癥、抗?jié)儭⒔档湍懝檀?、降血糖、抗皮膚過敏等重要功效［2－3］。國外對麥苗的開發(fā)與利用從19世紀(jì)開始，美國人安·威格摩爾創(chuàng)立了以麥苗為主的“生食療法”。近年來麥苗作為功能食品的研究在我國逐漸得到關(guān)注［4］。研究表明，麥苗中含有多種人體必需的氨基酸，豐富的抗氧化成分，如VC、VE、黃酮化合物、多酚等，表現(xiàn)出較高的抗氧化活性［5］。施瑛等［6］采用亞油酸法測得麥苗抗氧化活性分別是BHT、α－生育酚的4.9倍和7.2倍;黃嘌呤氧化酶法測得其SOD活性是葡萄的7倍，并且有一定的GSH－Px活性和自由基清除活性。

抗氧化協(xié)同效應(yīng)是指通過對不同抗氧化物之間進(jìn)行優(yōu)選和配方處理，可以獲得比單一抗氧化劑高得多的抗氧化能力，提高生物體的氧化穩(wěn)定性［7］。Tappel等［8］在1962年對VC和VE協(xié)同作用的研究中就提出了VC再生VE的觀點(diǎn)。王岳飛等的研究表明不同濃度的茶多酚和西洋參之間存在一定的協(xié)同增效作用［9］。劉中立等［10］證實(shí)了茶多酚與VE的協(xié)同抗氧化。普遍存在于麥苗中的阿魏酸、黃酮物質(zhì)、抗壞血酸都有較高的抗氧化活性，但是這3種抗氧化活性物質(zhì)在小麥中的協(xié)同抗氧化研究依然鮮見。本研究根據(jù)麥苗中3種抗氧化組分含量測定數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過標(biāo)準(zhǔn)品配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，模擬含量水平相互復(fù)配組合，分析抗氧化能力，以期研究麥苗中各組分的協(xié)同抗氧化作用，了解麥苗的抗氧化活性特點(diǎn)，為麥苗的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

小麥品種川麥107，葉片采樣按小麥苗生長期計(jì)，每次取樣10～15株。

反式阿魏酸(Ferulic Acid，F(xiàn)A，純度 ＞99%);抗壞血酸(Ascorbic Acida，AA，純度 ＞99.9%:德國SIGMA－ALDRICH公司;蘆丁(總黃酮測定對照，純度 ＞99.9%);DPPH，ABTS(純度≥99.0%):成都杰銳生物科技有限公司分裝。

LC－10A高效液相色譜儀(配紫外檢測器):日本島津公司Milli－Q型純水儀:美國密理博公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 麥苗中3種抗氧化組分的測定方法

分別測定小麥葉片中阿魏酸，抗壞血酸，以及總黃酮在2011年1月～3月中總共10個(gè)時(shí)期(采樣次數(shù))的含量，抽穗后停止采樣。

抗壞血酸測定采用GB/T 5009.86—2003中2，4－二硝基苯肼法［11］;總黃酮含量采用乙醇超聲提取，360 nm處吸光度［12］;阿魏酸含量采用高效液相色譜法進(jìn)行測定［13］。

1.2.2 抗氧化活性測定方法

參考郭文莉等［14］和 Roberta 等［15］的方法，采用DPPH法和ABTS法分別測定單一組分以及組配混合物的抗氧化活性。

麥苗汁總抗氧化活性測定取新鮮麥苗20 mg于離心管中，按上述方法測定DPPH·和ABTS+·清除率，分析麥苗汁總抗氧化活性。同時(shí)，將濃度為40、60、80、100、120、160、200 μg/mL 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液作為抗氧化活性的陽性對照。

1.2.3 協(xié)同抗氧化能力的分析

1.2.3.1 單一組分的抗氧化活性的測定

分別配制濃度為 1、2、4、6、8 μg/mL 的抗壞血酸、蘆丁、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2分別測定抗氧化活性。

1.2.3.2 兩組分間的協(xié)同抗氧化活性的測定

每種抗氧化物質(zhì)取3個(gè)濃度:1、2、4μg/mL，每兩種物質(zhì)之間3種濃度兩兩組合，配制復(fù)合溶液，按1.2.2測定復(fù)合溶液的抗氧化活性。

1.2.3.3 3 組分間的協(xié)同抗氧化活性

對抗壞血酸、蘆丁、阿魏酸分別取1、2、4μg/mL 3個(gè)濃度水平進(jìn)行三因素三水平的析因設(shè)計(jì)試驗(yàn)，考察組合溶液對DPPH·的清除率。

上述試驗(yàn)每組平行測定3個(gè)樣品，通過SPSS 18.0分析軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直接比較分析、析因分析和回歸分析，結(jié)合1.2.2對麥苗汁總抗氧化活性測定結(jié)果分析3組分間的協(xié)同抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥苗中3種抗氧化組分在不同時(shí)期含量變化

本研究測定分析了在1月～3月小麥葉片中的阿魏酸，抗壞血酸，以及總黃酮的含量及變化趨勢(圖1)。結(jié)果表明，總黃酮含量明顯高于阿魏酸和抗壞血酸含量，平均達(dá)到773.78 mg/100 g，其變化范圍在676.37 ～855.77 mg/100 g波動(dòng)，其變化趨勢是先增加，在2月中旬有所降低，隨后在3月中旬到達(dá)最高，其原因可能與各類黃酮類物質(zhì)間轉(zhuǎn)換有關(guān)。在2～3月期間，田間溫度迅速回升，有利于麥苗生物產(chǎn)量的增加和功能物質(zhì)的積累，表明總黃酮可能是小麥苗中主要的抗氧化成分。

圖1 麥苗中阿魏酸(FA)，抗壞血酸(AA)，總黃酮含量變化

在3種物質(zhì)中，阿魏酸平均含量最低，僅為34.07 mg/100 g(變幅 25.9 ～52.4 mg/100 g)，而且隨苗期變化幅度較小，呈緩慢增加。阿魏酸是近年來研究較多的抗氧化物質(zhì)，在多種植物中均存在，但是本研究中小麥苗阿魏酸含量較低?？箟难崞骄?146.51 mg/100 g，最高為 226.29 mg/100 g，此時(shí)期為幼苗期(2月初)田間尚未拔節(jié)和分蘗，柔嫩的小麥葉片中抗壞血酸含量較高，隨著生育期延長，麥苗中纖維素、木質(zhì)素增加，其抗壞血酸含量降低，最低僅為 104.02 mg/100 g。

2.2 麥苗汁的抗氧化活性

稱取25 mg新鮮麥苗于10 mL離心管中，用玻璃棒搗碎后加入DPPH·或ABTS+·反應(yīng)體系7或20 mL，然后測定濾液的吸光值。由于吸光度較大清除率DPPH清除率在80% ～90%之間，而ABTS+·清除率接近100%，無法以濃度梯度計(jì)算其IC50值。因此試驗(yàn)將麥苗汁用超純水稀釋定容至50 mL，然后測定量效關(guān)系，分別取 1、2、4、5、6、8 mL 樣品溶液用蒸餾水定容于10 mL容量瓶中，然后分別用DPPH和ABTS測定法其抗氧化活性，結(jié)果見圖2。同法測定麥苗汁在10個(gè)不同時(shí)期的抗氧化能力(圖3)。

圖2 麥苗汁稀釋液抗氧化性的量效關(guān)系變化

圖3 不同采樣時(shí)期麥苗汁抗氧化活性

從圖2可以明顯的看出，隨著所用麥苗汁稀釋液體積的加大，其抗氧化能力明顯加強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，但線性關(guān)系不明顯。當(dāng)反應(yīng)液中麥苗汁體積為2 mL DPPH·清除率即達(dá)到83.23%，此時(shí)ABTS+·的清除率也達(dá)到了69.49%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，隨著麥苗汁稀釋液的體積的增加在4 mL時(shí)，抗氧化活性達(dá)到最大值，此時(shí)清除率分別為86.45%和88.63%。對比抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液對DPPH·和ABTS+·的清除率(表1)可知，20 mg的麥苗制成的麥苗汁稀釋液4 mL對DPPH·和ABTS+·的清除率就可達(dá)80%以上，相當(dāng)于200μg/mL的抗壞血酸2 mL(即0.4 mg)抗壞血酸對DPPH·和ABTS+·的清除率，說明麥苗汁具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

表1 抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)液對DPPH·和ABTS+·的清除率

按上述方法將10個(gè)采樣時(shí)期的20 mg新鮮小麥葉片榨汁，稀釋并以2 mL加入反應(yīng)體系中。麥苗汁隨生長周期的變化清除DPPH·和ABTS+·的變化趨勢表明(圖3)，麥苗汁清除DPPH·能力隨小麥苗生長周期的變化而呈上升趨勢，麥苗汁ABTS+·清除率變化趨勢較DPPH·清除率上升趨勢不明顯，僅從1月底的81.20%上升到3月底(第10次采樣)94.74%，增加幅度為13.54%。而ABTS+·的清除率則從1月底的43.90%，急劇增加到92.14%，其在小麥苗期，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性，其平均ABTS+·和DPPH·清除率分別達(dá)到90.76%和74.34%。

2.3 小麥苗中3種抗氧化組分的協(xié)同抗氧化作用分析

為了解苗期小麥葉片中3種抗氧化組分對抗氧化活性的協(xié)同作用特點(diǎn)，本研究用抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對協(xié)同抗氧化能力進(jìn)行分析。并結(jié)合上述麥苗汁抗氧化分析結(jié)果，采用直觀分析、析因分析和回歸分析研究組分間的協(xié)同作用。

2.3.1 單一組分的抗氧化活性分析

由圖4可知，單一組分具有較高的抗氧化能力，且抗氧化能力與濃度呈正相關(guān)。在低濃度時(shí)，蘆丁對DPPH·的清除率比相同濃度的抗壞血酸和阿魏酸要強(qiáng)，對ABTS+·的清除率強(qiáng)于抗壞血酸，但比阿魏酸要弱;隨著濃度的增加，抗壞血酸對DPPH·的清除率增大，且要強(qiáng)于蘆丁和阿魏酸;隨著濃度的變化，阿魏酸對ABTS+·的清除率始終強(qiáng)于抗壞血酸和蘆丁，當(dāng)質(zhì)量濃度為 8.0 μg·mL－1時(shí)，其對ABTS+·的清除率達(dá)到86.24%，但其對DPPH·的清除率則較低。抗壞血酸的清除能力在質(zhì)量濃度大于2.5μg·mL－1時(shí)逐漸比蘆丁強(qiáng)，這可能與它們的結(jié)構(gòu)以及抗氧化機(jī)理有關(guān)，不同抗氧化劑提供氫的羥基位置不同，其活潑程度不同，所以抗氧化性能不同。

圖4 各組分對DPPH·和ABTS+·的清除率

2.3.2 組分間的協(xié)同抗氧化活性分析

分別配制1、2、4 μg·mL－1的 3種不同抗氧化劑，并且兩兩組合為混合溶液，應(yīng)用DPPH法和ABTS法測其抗氧化能力，結(jié)果如表2所示。由表2可知，抗壞血酸與蘆丁的混合溶液對DPPH·和ABTS+·的清除率均比單一組分清除率之代數(shù)和低，但大于各單一組分清除率。因此，抗壞血酸與蘆丁具有協(xié)同抗氧化作用。當(dāng)抗壞血酸濃度不變時(shí)，組合溶液對自由基的清除率與蘆丁的濃度呈正相關(guān)變化。當(dāng)蘆丁濃度不變時(shí)，復(fù)配溶液對自由基的清除率與抗壞血酸的濃度未呈現(xiàn)明顯相關(guān)性。由此可知，蘆丁對總抗氧化能力的作用大于抗壞血酸。

抗壞血酸與阿魏酸的混合溶液對DPPH·和ABTS+·的清除率均比單一組分清除率的代數(shù)和高，即抗壞血酸與阿魏酸的協(xié)同抗氧化活性大于其單一組分之和。但是當(dāng)抗壞血酸濃度較高時(shí)，抗壞血酸與阿魏酸的混合液對DPPH·的清除率略小于單一組分代數(shù)和，但均大于各單一組分對DPPH·的清除率。當(dāng)阿魏酸或抗壞血酸的濃度不變時(shí)，混合液對自由基的清除率隨抗壞血酸或阿魏酸的濃度升高而升高?？梢?，抗壞血酸與阿魏酸的組合溶液的協(xié)同抗氧化性比抗壞血酸與蘆丁溶液組合的協(xié)同抗氧化性高。

表2表明，除當(dāng)阿魏酸質(zhì)量濃度為1μg·mL－1的復(fù)配溶液對ABTS+·清除率大于單一組分清除率的代數(shù)和外，阿魏酸與蘆丁的復(fù)配溶液對DPPH·和ABTS+·的清除率均小于其單一組分清除率之代數(shù)和，但均大于各單一組分的清除率。即阿魏酸與蘆丁具有協(xié)同抗氧化作用。同時(shí)，當(dāng)一種組分濃度不變時(shí)，復(fù)配溶液對自由基清除率與另一組分濃度的呈正相關(guān)變化。阿魏酸濃度變化對抗氧活性的影響大于蘆丁的影響，即阿魏酸對抗氧化能力的作用大于蘆丁。綜上表明，相同濃度下，3種組合中阿魏酸與抗壞血酸的復(fù)配溶液對自由基的清除率最大，其次是阿魏酸與蘆丁的復(fù)配溶液，最后是抗壞血酸與蘆丁的復(fù)配溶液。

表2 不同抗氧化劑組合溶液對DPPH·和ABTS+·的清除作用

分別配制1、2、4μg/mL的抗壞血酸、蘆丁、阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)組合溶液，測其抗氧化能力，結(jié)果如表3所示。當(dāng)兩種組分濃度不變時(shí)，復(fù)配組分對自由基的清除率與第3種組分的濃度呈正相關(guān);當(dāng)蘆丁質(zhì)量濃度為1μg/mL時(shí)，復(fù)配組分對DPPH·和ABTS+·的清除率小于各單一組分清除率之代數(shù)和;當(dāng)蘆丁質(zhì)量濃度為2和4μg/mL時(shí)，復(fù)配組分對DPPH·和ABTS+·的清除率均大于各單一組分清除率之代數(shù)和，說明蘆丁在高濃度時(shí)，其協(xié)同抗氧化能力更強(qiáng)。復(fù)配組分對自由基的清除率均大于單一組分的清除率，說明抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁之間存在協(xié)同抗氧化效應(yīng)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，當(dāng)抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁的質(zhì)量濃度均為4μg·mL－1時(shí)，復(fù)配組分對DPPH·和ABTS+·的清除率達(dá)到最大，分別為52.86%和76.47%，當(dāng)抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁的質(zhì)量濃度分別為 1、1、4 μg·mL－1時(shí)，3 組分對 DPPH·的清除率比單一組分代數(shù)和的清除率提高62.9%;當(dāng)抗壞血酸、阿魏酸、蘆丁的質(zhì)量濃度分別為 2、2、4 μg·mL－1時(shí)，3組分對ABTS+·的清除率比單一組分清除率代數(shù)和提高8.9%。對比兩兩組合的復(fù)配溶液，相同濃度下，3組分混合液對自由基的清除率有明顯提高，即3種物質(zhì)的協(xié)同抗氧化能力大于其中任何兩種抗氧化物質(zhì)的組合。

2.3.3 組分間的協(xié)同抗氧化活性的析因分析

本研究對3標(biāo)準(zhǔn)組分的抗氧化能力及協(xié)同抗氧化能力采用析因設(shè)計(jì)，該法可檢驗(yàn)每個(gè)因素各水平間的差異，以及各因素間的交互作用［16］。每組分取3 個(gè)水平:1.0、2.0、4.0 μg·mL－1，每個(gè)組合重復(fù) 2次，對結(jié)果采用SPSS軟件進(jìn)行處理，方差分析結(jié)果如表4所示。由表3可知，3組分的 P=0.000＜0.05，說明3組分的濃度不同，抗氧化能力的大小也不同;對于一階交互效應(yīng)，3者的 P=0.000＜0.05，說明3組分間兩兩之間均存在交互作用，兩兩之間均對彼此的抗氧化能力存在顯著影響;對于二階交互效應(yīng)，P=0.000＜0.05，說明3組分存在顯著的交互作用。

表3 3組分組合對DPPH·和ABTS+·的清除作用

表4 析因試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

2.3.4 組分間的協(xié)同抗氧化活性的回歸分析

以混合物對DPPH·的清除率為因變量Y，抗壞血酸、阿魏酸和蘆丁的濃度為自變量X1、X2和X3，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行逐步回歸分析。模型輸出結(jié)果如表5所示。隨著自變量被逐步引入回歸方程，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R和決定系數(shù)R2在逐漸增大，說明引入的自變量對總清除率的作用在增加。其中決定系數(shù)R2=0.830，則剩余因子=0.312，該值較大，說明對清除率有影響的自變量不僅有以上3種物質(zhì)，還有一些影響較大的因素沒有考慮到，還有待于進(jìn)一步研究。

表5 逐步回歸模型分析

用spss軟件對模型進(jìn)行回歸分析表明，線性回歸方程為:y= －1.879+3.167x1+2.673x2+7.920x3。自變量x1、x2、x3對 Y的作用的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)分別是:P1y=0.323，P2y=0.272，P3y=0.807，即 3 種物質(zhì)對總清除率的影響大小是:蘆丁﹥抗壞血酸﹥阿魏酸。即蘆丁對總抗氧化能力的貢獻(xiàn)率最大，抗壞血酸次之，阿魏酸最小。顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明，x1、x2、x3的偏回歸系數(shù)的顯著性均小于0.05，說明自變量與因變量之間存在顯著性差異。經(jīng)偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)表明，3者之間存在著極顯著地交互作用(P＜0.01)，即3者有著顯著地協(xié)同抗氧化作用。

3 討論

已有研究表明［17－19］，麥苗中抗壞血酸、阿魏酸、總黃酮的含量分別為 168.41、37.6、770.0 mg/100 g，三者含量比約為22∶5∶1，綜合以上結(jié)論分析，麥苗對DPPH·的清除率將在30%左右，而對ABTS+·的清除率將在60%左右。因此，麥苗中的抗氧化組分具有協(xié)同抗氧化作用，且抗氧化能力較高。

抗氧化活性大小與抗氧化劑分子中酚羥基數(shù)目及新生成自由基的穩(wěn)定性呈正相關(guān)。不同抗氧化劑提供氫的羥基位置不同，其活潑程度不同，所以抗氧化性能不同。不同抗氧化劑復(fù)配使用時(shí)，其抗氧化效果優(yōu)于單獨(dú)一種抗氧化劑的抗氧化效果，這是因?yàn)閮煞N或兩種以上的抗氧化劑復(fù)配使用時(shí)，各種抗氧化劑在抗氧化之后，產(chǎn)生的游離基會(huì)相互作用生成新的酚類化合物，繼續(xù)發(fā)揮抗氧化作用，使其抗氧化性能得以增強(qiáng)［20］。1962年，Tappel率先開展了VE與VC間協(xié)同作用的研究，并提出了VC再生VE的觀點(diǎn)。除此之外，其它抗氧化劑間的協(xié)同作用也有文獻(xiàn)報(bào)道如兒茶素與VC、VE共同使用對豬油抗氧化有明顯的協(xié)同增效作用［21］。

抗氧化的機(jī)理研究表明，抗氧化劑作用機(jī)理并不完全相同。有的提供質(zhì)子，捕獲自由基，而本身形成穩(wěn)定的共振結(jié)構(gòu)而阻斷氧化(如黃酮類化合物);有的與氧作用而消耗密閉系統(tǒng)中殘留的氧(如VC及其鹽類);有的可與金屬離子形成螯合物，減少金屬離子對氧化作用的催化活性(如檸檬酸、植酸等);有的能破壞單旋態(tài)氧(1O2)而抑制光氧化的進(jìn)行(如胡蘿卜素)等等。如將這些具有不同抗氧化性能的物質(zhì)混合在一起，抗氧化的整體效果自然要增強(qiáng)。另外，不同抗氧化劑共同使用時(shí)，抗氧化劑自由基之間可能互相還原，使抗氧化劑再生［21］。因此，協(xié)同抗氧化作用既不是各種抗氧化劑抗氧化作用的簡單加合，也不是它們的相乘關(guān)系，而是各種抗氧化劑在抗氧化作用不同方面發(fā)揮作用，從而從整體上表現(xiàn)為抗氧化效果大大增強(qiáng)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，阿魏酸與抗壞血酸的復(fù)配溶液對自由基的清除率最大，其次是阿魏酸與蘆丁的復(fù)配溶液，最后是抗壞血酸與蘆丁的復(fù)配溶液。對3組分進(jìn)行協(xié)同抗氧化能力分析，發(fā)現(xiàn)3者間存在顯著的協(xié)同抗氧化性，回歸分析表明，3組分中蘆丁對總抗氧化能力的貢獻(xiàn)率最大，抗壞血酸次之，阿魏酸最小。利用3種物質(zhì)的抗氧化協(xié)同作用并不能完全的解釋麥苗較強(qiáng)的抗氧化活性，說明麥苗的抗氧化性受多種組分的影響，需要考察更多的組分，以了解其抗氧化特點(diǎn)。

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