MK-801誘導(dǎo)的精神分裂癥小鼠行為學(xué)和胼胝體髓鞘的改變☆

修蕓 張蕾 仇玄 陳林 盧偉 彭超 程國華 晁鳳蕾 唐勇

精神分裂癥（schizophrenia，SZ）是一組常見的病因未完全闡明的精神疾病，多起病于青壯年。多巴胺亢進[1]、5-羥色胺功能異常[2]及谷氨酸[3-4]功能低下等被認(rèn)為是SZ的主要發(fā)病原因。近來研究表明SZ患者大腦白質(zhì)存在體積減小[5-8]，及髓鞘蛋白和少突膠質(zhì)細胞相關(guān)蛋白低表達等病理改變[9-12]，提示白質(zhì)紊亂可能參與SZ發(fā)病[13-14]。本研究擬采用C57BL/6J小鼠長期腹腔注射地卓西平馬來酸鹽（dizocilpine，MK-801）制備SZ動物模型，并研究該動物模型的行為學(xué)改變和胼胝體內(nèi)髓鞘相關(guān)蛋白及髓鞘超微結(jié)構(gòu)的改變，以期為SZ的白質(zhì)改變假說尋找進一步的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8周齡雄性C57BL/6J小鼠（清潔級）48只（購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心），隨機分為SZ慢性給藥模型組（M1、M2、M3）和對照組，每組12只。實驗前小鼠在動物房飼養(yǎng)至少3 d，進入研究時小鼠體重為20～25g。

1.2 藥物及給藥方法 MK-801購自美國Sigma公司，以生理鹽水配成5mg/mL的儲備液，后按比例稀釋成不同濃度的工作液（每日現(xiàn)配現(xiàn)用）。M1～M3組小鼠分別腹腔注射（10mL/kg，q.d.）0.025mg/mL、0.050mg/mL和0.100mg/mL的MK-801，對照組小鼠則注射等體積生理鹽水。每日下午1:00～2:00注射，共持續(xù)2周。

1.3 行為學(xué)實驗

1.3.1 Morris水迷宮實驗 模型制備第9天即開始水迷宮測試，為避免MK-801急性注射對測試造成影響，測試時間為每日上午9:00～12:00。實驗周期共7天，前6天為隱匿平臺期，第7天為撤平臺實驗。每次實驗限時1min，記錄小鼠逃避潛伏期、穿越原平臺位置的次數(shù)及目標(biāo)象限滯留時間等參數(shù)。

1.3.2 探孔實驗 將小鼠置于孔板（UGO Basile，意大利）中央，安靜環(huán)境下任其自由活動3～5min，記錄其頭伸入孔洞中的次數(shù)。

1.3.3 轉(zhuǎn)棒實驗 實驗前1h訓(xùn)練小鼠1次，實驗開始時將小鼠置于固定低轉(zhuǎn)速（4 r/min）的轉(zhuǎn)棒（UGO Basile，意大利）上適應(yīng)條件，隨后啟動加速，4min內(nèi)由4 r/min增加到40 r/min，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時間。共測試3次，測試間隔至少15min。

1.4 免疫組化及電鏡實驗 模型制備第16天，行為學(xué)測試結(jié)束6h后取腦組織進行免疫組化染色和電鏡實驗。

1.4.1 免疫組化 5μm石蠟切片經(jīng)脫蠟及PBS漂洗，抗原熱修復(fù)20min，3%過氧化氫封閉10min；以髓鞘堿性蛋白抗體（anti-MBP，1:200稀釋，Sigma-Aldrich公司）37℃孵育 1.5h，二抗孵育 30min后DAB顯色。顯微鏡（Nikon，日本）下采圖，并以Image-Pro Plus 6.0分析，MBP 染色系數(shù)=髓鞘染色OD值/灰質(zhì)染色OD值。

1.4.2 電鏡實驗 將大腦半球沿冠狀面切成1mm的連續(xù)切片，每只動物隨機抽取4張腦組織切片，并于尾側(cè)面隨機疊加透明等距測試框，在測試點擊中胼胝體的部位取1mm3大小的組織塊。將胼胝體組織以電鏡標(biāo)本制備方法常規(guī)固定處理，按“球切法”（isector）包埋制備超薄切片，透射電鏡下隨機選取12個視野采圖（放大20 000倍）。采用體視學(xué)方法[15]計數(shù)損傷神經(jīng)纖維比例，有髓神經(jīng)纖維損傷比例（%）=損傷有髓神經(jīng)纖維總數(shù)/有髓神經(jīng)纖維總數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。逃避潛伏期數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量方差分析；其余數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，并用Dunnett-t檢驗進行對照組和各模型組間的比較。檢驗水準(zhǔn)α為0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)測試結(jié)果 注射MK-801后0.5h，小鼠自發(fā)活動及刻板性行為增加，M2和M3組小鼠出現(xiàn)后肢肌力障礙和明顯的共濟失調(diào)，1～2h后此癥狀消失。

2.1.1 水迷宮實驗 隱匿平臺實驗階段，MK-801處理因素主效應(yīng)無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.761，P=0.522），時間效應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=127.361，P＜0.001），但時間和處理的交互效應(yīng)（day×group）無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.146，P=0.337），即時間因素的作用不隨著分組的不同而不同。見表1。空間探索實驗階段，各組動物間目標(biāo)象限停留時間（F=0.157，P=0.925）、穿越平臺次數(shù)（F=0.220，P=0.882）、平均游泳速度（F=0.843，P=0.478）及游泳總路程（F=0.928，P=0.436）的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.1.2 探孔實驗 MK-801處理組小鼠經(jīng)常出現(xiàn)在孔板中央靜止不動的現(xiàn)象。單因素方差分析顯示，各組間動物 3min（F=11.826，P＜0.001）和 5min（F=9.549，P＜0.001）探孔次數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Dunnett-t檢驗示，M1（P=0.001）、M2（P=0.018）和 M3（P＜0.001）組3min 探孔次數(shù)均低于對照組；但5min內(nèi)探孔次數(shù)，僅M1（P=0.017）和M3（P＜0.001）組探孔次數(shù)低于對照組，而M2組與對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.076）。見表3。

2.1.3 轉(zhuǎn)棒實驗 各組間小鼠在轉(zhuǎn)棒上的停留時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.815，P＝0.493）。見表4。

2.2 髓鞘形成相關(guān)蛋白MBP表達缺失和髓鞘損傷 免疫組化結(jié)果見圖1，各模型組MBP表達較低，染色呈斑塊狀缺失，M1、M2和M3各模型組染色系數(shù)分別為（179±10）%、（235±7）%和（152±9）%；而對照組MBP表達完整，染色較深，染色系數(shù)為（288±18）%。單因素方差分析顯示各組間MBP染色差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.269，P＜0.001），Dunnett-t檢驗示，M1（P＜0.001）、M2（P=0.005）和 M3 組（P＜0.001）MBP 染色均低于對照組。電鏡下髓鞘超微結(jié)構(gòu)分析顯示，對照組小鼠大腦胼胝體髓鞘結(jié)構(gòu)完整，而各模型組小鼠大腦胼胝體髓鞘出現(xiàn)不同程度的板層分離、節(jié)段性脫髓鞘等病變。見圖2。體視學(xué)計數(shù)及t檢驗顯示，M3組小鼠胼胝體內(nèi)損傷有髓神經(jīng)纖維比例（22.42±4.24）%高于對照組（3.84±1.35）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。

表1 小鼠水迷宮隱匿平臺實驗逃避潛伏期（±s，單位：s）

表1 小鼠水迷宮隱匿平臺實驗逃避潛伏期（±s，單位：s）

組別M1組M2組M3組對照組n 10 12 12 12第1天47.06±12.90 43.88±11.36 40.47±12.03 42.24±11.06第2天33.28±19.55 24.59±14.41 28.87±16.63 26.97±15.60第3天21.72±14.50 12.34±5.48 21.60±18.42 11.34±5.85第4天12.93±11.10 11.58±5.69 14.08±14.48 10.49±3.88第5天8.32±3.43 6.56±2.48 11.26±13.33 9.31±3.05第6天7.44±3.02 6.43±1.93 9.06±8.04 7.73±3.79

表2 小鼠水迷宮空間探索實驗數(shù)據(jù)（±s）

表2 小鼠水迷宮空間探索實驗數(shù)據(jù)（±s）

組別M1組M2組M3組對照組n 10 12 12 12穿臺次數(shù)2.60±1.33 2.54±1.67 3.08±1.69 2.67±2.30平均泳速（cm/s）27.34±5.13 25.84±5.46 25.66±5.49 28.28±1.76目標(biāo)象限停留時間（s）23.56±7.61 26.24±9.41 25.21±9.84 26.39±7.10游泳總路程（cm）1641.54±307.94 1551.22±327.55 1530.83±326.60 1699.13±103.80

表3 小鼠探孔次數(shù)（±s）

表3 小鼠探孔次數(shù)（±s）

1）與對照組比較，經(jīng)Dunnett-t檢驗，P＜0.01；2）與對照組比較，經(jīng)Dunnett-t檢驗，P＜0.05

組別M1組M2組M3組對照組n 10 12 12 12 3min 19.80±5.391)23.45±7.742)14.67±3.631)30.75±8.96 5min 28.70±7.972)31.73±9.98 18.75±8.251)39.42±11.45

表4 小鼠轉(zhuǎn)棒上停留時間（±s，單位：s）

表4 小鼠轉(zhuǎn)棒上停留時間（±s，單位：s）

組別M1 M2 M3對照n 10 12 12 12第1次119.60±32.27 110.64±26.30 122.92±35.85 116.33±26.98第2次119.30±35.17 139.64±29.66 143.50±39.70 122.50±23.85第3次139.20±52.92 140.27±30.99 144.00±25.58 131.17±40.83 3次平均126.03±24.94 130.18±16.63 136.81±25.66 123.33±20.92

圖1 不同劑量MK-801組小鼠胼胝體MBP免疫組化結(jié)果（標(biāo)尺=100μm）A.M1組（MK-801 0.25mg/kg）；B.M2組（MK-801 0.50mg/kg）；C.M3組（MK-801 1.00 mg/kg）；D.對照組

圖2 不同劑量MK-801組小鼠胼胝體髓鞘結(jié)構(gòu)（箭頭示板層分離，星號示沃勒變性）A.M1組；B.M2組；C.M3組；D.對照組

3 討論

以苯環(huán)己哌啶、MK-801等制備的SZ動物模型，因能較好地模擬SZ的陰性、陽性癥狀，被廣泛應(yīng)用于SZ發(fā)病機制的研究中[3-4,16-20]。以往研究顯示，神經(jīng)化學(xué)、解剖改變[3-4,17-20]及神經(jīng)元死亡是MK-801誘發(fā)SZ的主要原因：Elhardt等[18]發(fā)現(xiàn)連續(xù)15天腹腔注射MK-801（0.1mg/kg）可引起C57乳鼠海馬區(qū)域錐體神經(jīng)元排列雜亂，細胞間復(fù)雜聯(lián)系減少，細胞基底樹突數(shù)量減少及長度變短；但Yu等[19]的研究卻顯示0.6mg/kg MK-801連續(xù)處理7天可增加C57小鼠前額葉皮質(zhì)和腹側(cè)被蓋區(qū)神經(jīng)元樹突總長度；Okamura等[20]研究甚至發(fā)現(xiàn)MK-801可引起大鼠壓后部皮質(zhì)Ⅲ-Ⅳ層神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)空泡。顯然，研究者對MK-801誘導(dǎo)SZ的研究主要聚焦在突觸和神經(jīng)元上，很少關(guān)注白質(zhì)改變。本研究首次在MK-801誘導(dǎo)的SZ小鼠大腦中發(fā)現(xiàn)MBP蛋白低表達，這與Lindahl等[21]和Zhang等[22]在PCP大鼠SZ模型上的研究結(jié)果一致；本研究尚發(fā)現(xiàn)MK-801可誘發(fā)胼胝體內(nèi)髓鞘出現(xiàn)板層分離、節(jié)段性脫髓鞘等損傷改變。髓鞘結(jié)構(gòu)在神經(jīng)沖動傳導(dǎo)和信息整合中發(fā)揮重要作用[13-14]，胼胝體脫髓鞘改變可能是慢性腹腔注射MK-801誘導(dǎo)SZ的病因之一。

本研究中，MK-801注射后1～2h內(nèi)（急性期）小鼠自發(fā)活動增加，0.50mg/kg和1.00mg/kg組小鼠尚出現(xiàn)后肢功能障礙和共濟失調(diào)，這與蘇允愛等[16]的研究結(jié)果一致；MK-801反復(fù)注射2周后小鼠表現(xiàn)出對新環(huán)境探索減少的SZ陰性癥狀，這與Yu等[19]的研究結(jié)果相似；轉(zhuǎn)棒實驗表明MK-801慢性期小鼠并無運動及協(xié)調(diào)能力障礙，這可排除運動障礙及不協(xié)調(diào)等因素對小鼠探孔次數(shù)減少造成影響，提示精神神經(jīng)因素在其中起主要作用。本研究中，反復(fù)給予MK-801并未引起小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的下降，與Li等[23]的研究結(jié)果不一致，這可能與測試時間及模型制備差異有關(guān)。Li等[23]采用未成年大鼠制備SZ模型，造模完成后進行水迷宮測試；本研究中，水迷宮測試在造模過程中（較Li等[23]的實驗提前1周）進行，是因為擬在造模后最短時間內(nèi)觀察MK-801能否引發(fā)髓鞘損傷，避免髓鞘修復(fù)對其產(chǎn)生影響，這是本研究的不足之處。

MK-801誘導(dǎo)的SZ模型小鼠中髓鞘損傷及髓鞘蛋白表達下調(diào)的研究結(jié)果，從動物水平為白質(zhì)/髓鞘功能紊亂參與SZ發(fā)病提供了進一步的證據(jù)，并拓展了該小鼠模型的應(yīng)用。與神經(jīng)元不能再生不同，髓鞘可以修復(fù)，倘若白質(zhì)功能紊亂在SZ的發(fā)生中起作用，那少突膠質(zhì)細胞及其形成的髓鞘就有望成為治療SZ的潛在靶點[24]。MK-801反復(fù)給藥通過何種途徑誘發(fā)大腦白質(zhì)/髓鞘損傷，大腦白質(zhì)/髓鞘損傷又是如何參與SZ發(fā)病，尚需進一步的深入研究。

[1]Simpson EH,Kellendonk C,Kandel E.A possible role for the striatum in the pathogenesis of the cognitive symptoms of schizophrenia[J].Neuron,2010,65(5):585-596.

[2]Muguruza C,Moreno JL,Umali A,et al.Dysregulated 5-HT(2A)receptor binding in postmortem frontal cortex of schizophrenic subjects[J].Eur Neuropsypharmacol,2013,23(8):852-864.

[3]Neill JC,Barnes S,Cook S,et al.Animal models of cognitive dysfunction and negative symptoms of schizophrenia:Focus on NMDA receptor antagonism[J].Pharmacol Ther,2010,128(3):419-432.

[4]Mouri A,Noda Y,Enomoto T,et al.Phencyclidine animal models of schizophrenia:approaches from abnormality of glutamatergic neurotransmission and neurodevelopment[J].Neurochem Int,2007,51(2-4):173-184.

[5]Sanfilipo M,Lafargue T,Rusinek H,et al.Volumetric measure of the frontal and temporal lobe regions in schizophrenia:relationship to negative symptoms[J].Arch Gen Psychiatry,2000,57(5):471-480.

[6]McDonald C,Bullmore E,Sham P,et al.Regional volume deviations of brain structure in schizophrenia and psychotic bipolar disorder:computational morphometry study[J].Br J Psychiatry,2005,186:369-377.

[7]Zhou SY,Suzuki M,Hagino H,et al.Decreased volume and increased asymmetry of the anterior limb of the internal capsule in patients with schizophrenia[J].Biol Psychiatry,2003,54(4):427-436.

[8]Kubicki M,Park H,Westin CF,et al.DTI and MTR abnormalities in schizophrenia:Analysis of white matter integrity[J].Neuroimage,2005,26(4):1109-1118.

[9]Kerns D,Vong GS,Barley K,et al.Gene expression abnormalities and oligodendrocyte deficits in the internal capsule in schizophrenia[J].Schizophr Res,2010,120(1-3):150-158.

[10]Regenold WT,Phatak P,Marano CM,et al.Myelin staining of deep white matter in the dorsolateral prefrontal cortex in schizophrenia,bipolar disorder,and unipolar major depression[J].Psychiatry Res,2007,151(3):179-188.

[11]Hof PR,Haroutunian V,Copland C,et al.Molecular and cellular evidence for an oligodendrocyte abnormality in schizophrenia[J].Neurochem Res,2002,27(10):1193-1200.

[12]Takahashi N,Sakurai T,Davis KL,et al.Linking oligodendrocyte and myelin dysfunction to neurocircuitry abnormalities in schizophrenia[J].Prog Neurobiol,2011,93(1):13-24.

[13]Nave KA.Myelination and support of axonal integrity by glia[J].Nature,2010,468(7321):244-252.

[14]Fields RD.White matter in learning,cognition and psychiatric disorders[J].Trends Neurosci,2008,31(7):361-370.

[15]Tang Y,Nyengaard JR.A stereological method for estimating the total length and size of myelin fibers in human brain white matter[J].J Neurosci Methods,1997,73(2):193-200.

[16]蘇允愛,司天梅,周東風(fēng),等.MK-801建立谷氨酸功能低下精神分裂癥小鼠模型的研[J].中國神經(jīng)精神疾病雜志,2006,32(6):558-560.

[17]Guo C,Yang Y,Su Y,et al.Postnatal BDNF expression profiles in prefrontal cortex and hippocampus of a rat schizophrenia model induced by MK-801 administration[J].J Biomed Biotechnol,2010,2010:783297.

[18]Elhardt M,Martinez L,Tejada-Simon MV.Neurochemical,behavioral and architectural changes after chronic inactivation of NMDA receptors in mice[J].Neurosci Lett,2010,468(2):166-171.

[19]Yu J,Qi D,Xing M,et al.MK-801 induces schizophrenic behaviors through downregulating Wnt signaling pathways in male mice[J].Brain Res,2011,1385:281-292.

[20]Okamura N,Reinscheid RK,Ohgake S,et al.Neuropeptide S attenuates neuropathological,neurochemical and behavioral changes induced by the NMDA receptor antagonist MK-801[J].Neuropharmacology,2010,58(1):166-172.

[21]Lindahl JS,Kjellsen BR,Tigert J,et al.In utero PCP exposure alters oligodendrocyte differentiation and myelination in developing rat frontal cortex[J].Brain Res,2008,1234:137-147.

[22]Zhang R,He J,Zhu S,et al.Myelination deficit in a phencyclidine-induced neurodevelopmental model of schizophrenia[J].Brain Res,2012,1469:136-143.

[23]Li JT,Su YA,Guo CM,et al.Persisting cognitive deficits induced by low-dose,subchronic treatment with MK-801 in adolescent rats[J].Eur J Pharmacol,2011,652(1-3):65-72.

[24]Takahashi N,Sakurai T.Roles of glial cells in schizophrenia:possible targets for therapeutic approaches[J].Neurobiol Dis,2013,53:49-60.