血管性癡呆小鼠海馬組織GSK3β、p-GSK3β蛋白的動態(tài)表達(dá)及意義☆

范鳴玥郭艷蘇張維娜李玲董艷紅崔文柱呂佩源

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是由各種腦血管疾病（包括缺血性腦血管病、出血性腦血管?。?dǎo)致的獲得性、持續(xù)性智能障礙綜合征。腦缺血再灌注能導(dǎo)致嚙齒類模型動物細(xì)胞凋亡，并引起認(rèn)知功能障礙。糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3β）是一種絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶，在腦缺血缺氧損傷中發(fā)揮促凋亡作用，同時(shí)其與阿爾茨海默病中Aβ抑制海馬長時(shí)程增強(qiáng)[1]及Tau蛋白的異常磷酸化[2]有關(guān)，但有關(guān)其在VD中作用的報(bào)道甚少。本研究通過觀察反復(fù)腦缺血再灌注后較長時(shí)間內(nèi)海馬組織GSK3β及p-GSK3β Ser9的表達(dá)情況，探討GSK3β在VD發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究動物 8周齡健康雄性C57Bl/6小鼠（C57小鼠）96只，體重22～25g，SPF級，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號：0202165。實(shí)驗(yàn)前小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，飼養(yǎng)室室溫22～24℃，相對濕度50%～60%，12h明暗交替光照。實(shí)驗(yàn)前，將小鼠置于水迷宮內(nèi)自由游泳30s，排除有游泳障礙的動物。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為模型組、假手術(shù)組，再依術(shù)后不同時(shí)間分為2周、4周、6周3個(gè)亞組，每亞組16只。術(shù)后模型組小鼠共死亡8只，其中術(shù)后2周、4周、6周各死亡3只、2只、3只。

1.2 模型制備 手術(shù)操作參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行，小鼠腹腔注射10%水合氯醛（350mg/kg）麻醉后，仰臥位固定，頸部消毒，正中切口，于頸動脈鞘內(nèi)鈍性分離雙側(cè)頸總動脈，并以“4”號絲線同時(shí)結(jié)扎阻斷雙側(cè)血流20min，松開絲線恢復(fù)血流10min，然后再次阻斷血流20min，恢復(fù)血流10min，如此重復(fù)3次。第3次血流再灌注后觀察30min，如小鼠呼吸、心跳平穩(wěn)即縫合皮膚，放回籠中正常飼養(yǎng)。假手術(shù)組步驟同上，僅分離雙側(cè)頸總動脈，套絲線，但不阻斷血流。

1.3 學(xué)習(xí)、記憶能力測試

1.3.1 水迷宮實(shí)驗(yàn) 采用小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）測試。記錄術(shù)后第15 d、29 d、43 d小鼠游完全程時(shí)間作為學(xué)習(xí)成績。術(shù)后第16 d、30 d、44 d，再次測試上述指標(biāo)作為記憶成績。

1.3.2 跳臺實(shí)驗(yàn) 采用小鼠跳臺裝置（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）測試。記錄術(shù)后第15 d、29 d、43 d小鼠遭受電擊后首次找到安全臺的反應(yīng)時(shí)間作為學(xué)習(xí)成績。術(shù)后第16 d、30 d、44 d將小鼠直接放在安全臺上，同時(shí)給銅柵通電，記錄小鼠第一次從安全臺跳到銅柵上的潛伏時(shí)間作為記憶成績。

1.4 HE染色觀察海馬組織病理學(xué)變化 術(shù)后第16 d、30 d、44 d，行為學(xué)測試完畢后，相應(yīng)亞組各取6只小鼠，灌注后取腦組織制備石蠟組織標(biāo)本，冠狀切片，厚度5μm。經(jīng)HE染色后，在10×40倍光鏡下觀察海馬CA1區(qū)。

1.5 檢測海馬組織中GSK3β及p-GSK3β Ser9蛋白表達(dá)情況 術(shù)后第16 d、30 d、44 d，行為學(xué)測試完畢后，相應(yīng)亞組取6只小鼠，冰上取腦組織并分離出海馬，用細(xì)胞裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所）抽提海馬組織總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE蛋白電泳，4℃環(huán)境中100V恒壓轉(zhuǎn)膜1.5h，5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜0.5h；0.01mol/L PBS稀釋一抗（鼠抗β-actin，美國Santa Cruz公司，1：1000稀釋；兔 抗 GSK3β、p-GSK3βSer9，美 國 Cell Signaling Technology公司，均為1∶1000稀釋），4℃孵育過夜?？雇没蚩故鬅晒舛梗≧ockland公司，1：5000稀釋）反應(yīng)1h，Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。以β-actin作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，各組動物之間行為學(xué)測試結(jié)果及蛋白表達(dá)情況的分析采用兩因素（處理因素與時(shí)間因素）析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)、記憶能力測試

2.1.1 水迷宮實(shí)驗(yàn)各組小鼠學(xué)習(xí)階段游完全程時(shí)間經(jīng)析因分析示，處理主效應(yīng)（F=50.949，P＜0.001）和時(shí)間主效應(yīng)（F=5.188，P=0.008）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但2者交互效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.143，P=0.124）；經(jīng) SNK 法比較，以術(shù)后 4周時(shí)間最長（P＜0.05）。各組小鼠記憶階段游完全程時(shí)間經(jīng)析因分析示，處理主效應(yīng)（F=44.417，P＜0.001）、時(shí)間主效應(yīng)（F=5.507，P=0.006）及 2者交互效應(yīng)（F=3.606，P=0.032）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)SNK 法比較，以術(shù)后4周時(shí)間最長（P＜0.05）。見表1。

表1 術(shù)后2、4、6周各組小鼠水迷宮、跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

表1 術(shù)后2、4、6周各組小鼠水迷宮、跳臺實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）

1）與假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，經(jīng)SNK檢驗(yàn)，P＜0.05；2）與同組其它時(shí)間點(diǎn)比較，經(jīng)SNK檢驗(yàn)，P＜0.05

組別模型組2周4周6周假手術(shù)組2周4周6周n 水迷宮實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)階段游完全程時(shí)間（s） 記憶階段游完全程時(shí)間（s）跳臺實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)階段反應(yīng)時(shí)間（s） 記憶階段潛伏時(shí)間（s）13 14 13 67.85±36.151)110.00±25.721)2)80.00±44.631)63.85±24.251)108.93±23.871)2)67.38±38.901)88.69±71.511)128.93±96.251)68.69±43.831)85.23±72.701)50.07±10.391)67.92±29.541)16 16 16 36.44±17.50 43.69±40.612)29.75±22.89 29.00±20.54 36.75±42.222)36.00±36.51 19.94±7.41 24.50±9.37 23.56±8.67 191.63±111.64 140.19±68.97 142.00±59.74

2.1.2 跳臺實(shí)驗(yàn)各組小鼠學(xué)習(xí)階段反應(yīng)時(shí)間經(jīng)析因分析示，處理主效應(yīng)（F=45.492，P＜0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，時(shí)間主效應(yīng)（F=2.905，P=0.060）和2者交互效應(yīng)（F=2.576，P=0.082）無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組小鼠記憶階段潛伏時(shí)間的處理主效應(yīng)（F=37.572，P＜0.001）和時(shí)間主效應(yīng)（F=3.170，P=0.047）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但2者交互效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.397，P=0.674）。見表1。

2.2 海馬組織HE染色 模型組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目減少，排列松散、紊亂，細(xì)胞核體積變小、深染，呈核固縮表現(xiàn)，核仁消失，細(xì)胞質(zhì)呈強(qiáng)嗜酸性，見圖1 A1、A2、A3。術(shù)后4周僅有少量細(xì)胞形態(tài)正常。

假手術(shù)組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)目多，排列緊密、均勻，輪廓清楚，邊界整齊，細(xì)胞核大而圓，核仁清晰，染色質(zhì)豐富，胞漿清亮，見圖1 B1、B2、B3。

2.3 海馬組織GSK3β、p-GSK3β Ser9蛋白的表達(dá)各組小鼠GSK3β總蛋白表達(dá)的處理主效應(yīng)（F＜0.001，P=1.000）、時(shí)間主效應(yīng)（F=0.002，P=0.998）及2者交互效應(yīng)（F=0.012，P=0.988）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2和圖2。各組小鼠p-GSK3β總蛋白表達(dá)的，處理主效應(yīng)（F=58.036，P＜0.001）和時(shí)間主效應(yīng)（F=20.076，P＜0.001）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，2者交互效應(yīng)亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.470，P＜0.001）；經(jīng)SNK法比較，以術(shù)后4周表達(dá)最高（P＜0.05），見表2和圖2。

圖1 A1、A2、A3分別為模型組術(shù)后2周、4周、6周海馬組織形態(tài)（HE染色，10×40）；B1、B2、B3分別為假手術(shù)組術(shù)后2周、4周、6周海馬組織形態(tài)（HE染色，10×40）

圖2 術(shù)后2、4、6周各組小鼠GSK3β、p-GSK3β蛋白表達(dá)情況（1：假手術(shù)組，2：模型組）

表2 術(shù)后2、4、6周各組小鼠GSK3β蛋白、p-GSK3βSer9蛋白表達(dá)情況（±s）

表2 術(shù)后2、4、6周各組小鼠GSK3β蛋白、p-GSK3βSer9蛋白表達(dá)情況（±s）

1)與假手術(shù)組比較，經(jīng)SNK檢驗(yàn)，P＜0.05；2)與其它時(shí)間點(diǎn)比較，經(jīng)SNK檢驗(yàn)，P＜0.05

6周0.87±1.05 0.80±0.85組別模型組假手術(shù)組n 6 6 GSK3β/β-actin p-GSK3βSer9/β-actin 2周0.83±0.94 0.86±0.98 4周0.84±1.03 0.88±1.06 2周0.42±0.081)0.20±0.06 4周0.76±0.211)2)0.20±0.082）6周0.22±0.061)0.20±0.06

3 討論

短暫性腦缺血能引起選擇性神經(jīng)元壞死、細(xì)胞凋亡、靜止性梗塞，反復(fù)發(fā)生時(shí)可引起認(rèn)知下降[4]，與學(xué)習(xí)記憶功能關(guān)系密切的海馬神經(jīng)元對缺血損害非常敏感[5]。

目前使用較多的4血管阻斷（4-vessel occlusion，4-VO）法建立的大鼠反復(fù)缺血再灌注和慢性低灌流模型雖可引起不可逆的學(xué)習(xí)記憶損害，但操作較困難，動物死亡率較高。同時(shí)由于基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的限制，大鼠暫不適宜用于基因研究，從而給分子機(jī)制的研究和治療帶來限制。本實(shí)驗(yàn)采用雄性C57小鼠反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈的方法造成動物腦組織反復(fù)缺血再灌注，因其先天性后交通動脈不發(fā)達(dá)，不能及時(shí)代償前腦缺血，故在較長時(shí)間內(nèi)保持低灌注狀態(tài)[6]，與臨床VD的發(fā)病類似。另外，此法手術(shù)操作簡單、動物死亡率低。行為學(xué)測試結(jié)果也顯示術(shù)后小鼠出現(xiàn)持續(xù)的學(xué)習(xí)記憶能力障礙，經(jīng)HE染色證實(shí)海馬組織出現(xiàn)顯著病理學(xué)改變，均證明此模型是較理想的VD模型。

GSK3是一種絲氨酸—蘇氨酸蛋白激酶[7]，廣泛表達(dá)于真核生物中。它有α（51kDa）和β（46kDa）2種亞型，GSK3β在神經(jīng)系統(tǒng)中較豐富，p-GSK3β Ser9是其失活形式。最近研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β能通過多條途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但其在VD中是否起重要作用尚未明了。本實(shí)驗(yàn)中，各時(shí)間點(diǎn)GSK3β蛋白的表達(dá)變化在2處理組間未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示其可能不是參與反復(fù)缺血再灌注的形式，而p-GSK3β Ser9在較長時(shí)間內(nèi)表達(dá)持續(xù)增高，提示反復(fù)腦缺血再灌注損傷能在較長時(shí)間內(nèi)通過磷酸化形式抑制GSK3β的活性，可能是機(jī)體自身抵抗缺血再灌注損害、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。究其原因可能是腦缺血再灌注刺激可以激活細(xì)胞存活/凋亡相關(guān)的PI3K/Akt信號通路[8]，活化的Akt與GSK3β結(jié)合后，磷酸化其N端的Ser活性位點(diǎn)而使GSK3β失活，從而阻止凋亡發(fā)生[9]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切。氯化鋰可能通過增加p-GSK3β表達(dá)，改善脆性X綜合征基因敲除小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[10]。本次實(shí)驗(yàn)中，p-GSK3β Ser9表達(dá)持續(xù)增高的同時(shí)，觀察到小鼠出現(xiàn)持續(xù)的學(xué)習(xí)記憶功能障礙，與上述研究結(jié)果不一致。推測原因可能是反復(fù)缺血再灌注刺激引起的p-GSK3β Ser9表達(dá)增加只能在一定時(shí)間、一定程度上發(fā)揮保護(hù)作用，并不能完全阻止行為學(xué)受損的發(fā)展，小鼠的持續(xù)性認(rèn)知功能異?？赡苁嵌喾N機(jī)制共同參與的結(jié)果。p-GSK3β與認(rèn)知障礙之間的關(guān)系仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，而以p-GSK3β為靶點(diǎn)的進(jìn)一步研究有可能為VD的防治提供新的途徑。

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