環(huán)介導等溫擴增技術在病原菌檢測中的應用

劉 芳 黃靜敏 何永盛 李傳禮

（深圳市計量質量檢測研究院 廣東深圳 518131）

1 前言

分子生物學技術, 特別是PCR 作為一種簡便高效的核酸擴增技術，在食品和衛(wèi)生安全檢測方面發(fā)揮著重大作用。但PCR 方法操作過程須通過電泳才能觀察到實驗結果，不適用于現場檢測制約了現場快速檢測及基層實驗室普及應用。因此，開發(fā)一種簡易快捷、特異靈敏的核酸擴增檢測方法成為當務之急。環(huán)介導等溫擴增(Loop-mediated isothermal amplification, 簡稱LAMP) 技術是Notomi等[1]首先提出來的, 它依賴于4條特異性引物和一種具有鏈置換活性的DNA 聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在等溫條件下可高效、快速、特異地擴增靶序列。以其特異性強、靈敏度高、快速準確和操作簡單等優(yōu)點在核酸的科學研究、疾病的診斷和預防、動物胚胎的性別鑒定和轉基因食品檢測等領域得到了日益廣泛的應用。與PCR 相比，LAMP 反應在一般恒溫條件下進行，所需設備簡易、成本相對低廉，同時又能滿足快速檢測的需要，所以更具推廣性，特別適用于基層單位及現場檢測，有望成為一種簡易的常規(guī)檢測手段，具有廣闊的應用前景。

2 LAMP技術反應原理

LAMP技術是在恒溫的條件下敏感、高效、特異的擴增靶基因核酸序列，可分成起始階段、環(huán)擴增階段和延伸階段。主要利用2條內引物(FIP，BIP) 和2條外引物(F3，B3)特異性識別靶基因上的6 個特定區(qū)域，和具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)進行擴增（圖 1）。LAMP具有很高的專一性，因為只有當引物和靶基因上6個特殊區(qū)域都發(fā)生配對時才能進行擴增反應。通過添加反轉錄酶還可進行RNA序列的擴增（PTLAMP）。PCR已作為分子生物學一種基本工具，如分子克隆，而LAMP具有的多種特性可快速簡便地檢測樣品的核酸序列。而且通過以下幾方面的優(yōu)化，使LAMP成為快速簡便的診斷工具。

2.1 添加環(huán)引物

在LAMP法的基礎上，在啞鈴狀結構的5’末端的環(huán)狀單鏈部分導入具有互補序列的環(huán)引物（LB和LF）,能夠增加DNA合成的起點，可縮短擴增時間和增強它的靈敏度[2]。環(huán)引物現已普遍用于LAMP的實際應用中。

2.2 實時渾濁度檢測

只需一臺帶孵育功能以保證滿足LAMP反應動力學的分光光度計，不需要添加任何檢測試劑如熒光試劑。這是因為LAMP擴增反應會產生一種焦磷酸鎂的衍生物，此衍生物的生成與生成的擴增產物成正比，有研究表明通過對LAMP反應的實時渾濁度分析，有望對最初樣品中的DNA模板進行定量[3]。

2.3 熒光目視試劑

Tomita等[3]在LAMP反應體系中加入鈣黃綠素，可對反應終點進行有效判斷。鈣黃綠素與試劑中的錳離子結合時處于淬滅狀態(tài)，擴增反應的副產物焦磷酸離子與錳離子結合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出熒光。這種簡單清楚的判斷方法使一些設備簡陋的實驗室的使用不受限制。

圖1 靶序列上6個特異區(qū)域及引物設計

3 LAMP方法在檢測病原體微生物中的應用

LAMP技術初期階段主要用于多種食源性致病菌的快速檢測，已針對沙門氏菌(Salmonella spp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希氏菌（Escherichia coli,）、霍亂弧菌(Vibrio cholera e)等食源性致病菌的LAMP 檢測方法

3.1 沙門氏菌LAMP檢測

沙門氏菌是公認的食源性疾病最常見的病原菌之一，能引起人類腸胃和其他疾病。雖然基于PCR方法快速檢測沙門氏菌的方法已經建立，但是需要進行電泳分析并且用到昂貴的熱循環(huán)系統(tǒng)。2005年Kayoko Ohtsuka 等[5]利用上述LAMP方法對疑被感染沙門氏菌的110個水樣雞蛋中進行抽樣,經過緩沖蛋白胨水中37℃、20h 的前增菌, 檢測結果顯示, PCR 漏檢了10%, LAMP及分離培養(yǎng)的檢出率為100% , 但LAMP 比分離培養(yǎng)方法更快速、靈敏和特異。朱勝梅等[7]摸索了LAMP 檢測沙門氏菌的最佳檢測反應條件, 使沙門氏菌的DNA檢測靈敏度達10 fg/反應, 特異性100%; 對牛奶樣品中檢出限為102cfu/ mL。

3.2 大腸埃希氏菌(Escherichia.coli) LAMP檢測

大腸埃希氏菌種的一些特殊的血清型菌株具有致病性，能引起人類腹瀉，通常稱這類大腸桿菌為止瀉性大腸埃希氏菌。由于進食致瀉性大腸埃希氏菌污染的食品而引起的食源性疾病的發(fā)病率居高不下, 因此各國對此非常重視。致瀉性大腸埃希氏菌類型多、血清型復雜, 常規(guī)檢測方法難以有效地實現快速、靈敏和全面地檢測。Song 等[13]應用LAMP 技術實現了對腸道侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）和志賀氏菌同源基因ipaH 的檢測。整個實驗在2 h 內完成, 其檢測限達到8 cfu/反應, 與PCR比較, PCR 檢測限為8×102cfu/反應。

3.3 流感病毒（Influenza）LAMP檢測

流感病毒是引起人類流感的病原體之一，可導致一系列呼吸道疾病，從輕微的上呼吸道癥狀至急性呼吸窘迫綜合癥和多器官功能衰竭，甚至死亡。流感病毒早期的快速檢測對流感的防控非常重要。Ito等[4]針對流感病毒H1和H3亞型的HA基因及乙型流感病毒NP基因，建立了LAMP檢測方法，比商業(yè)的免疫層析試劑盒靈敏度和專一性更高。Jayawardena等[5]建立了禽流感H5N1特異LAMP技術，對近十年間人和禽的H5N1流感病毒均有理想的檢測效果，其靈敏度高達0.002 pfu／反應。

LAMP 技術現也成功地用于快速即時檢測其他重要的病原體，包括麻疹病毒[3]、登革熱病毒[7]、軍團菌[14]、肺孢子蟲性肺炎[1]等。

4 LAMP技術發(fā)展方向

LAMP技術初期階段主要用于多種食源性致病菌的快速檢測，而由于該技術敏感性高、等溫高效、操作簡便，有望成為發(fā)展中國家中很多危險傳染病的簡單快速的診斷方法。

4.1 肺結核（Tuberculosis,TB）LAMP檢測

TB是發(fā)展中國家中一種主要的傳染疾病。雖然現在其發(fā)病率在很多發(fā)展中國家已有所降低，但是影響范圍卻有擴大的趨勢。TB沒有被完全控制其中一個重要的原因是缺乏簡便可行且靈敏度比痰涂片檢測法高的診斷方法。Iwamoto等[19]建立了檢測肺結核分支桿菌、鳥分支桿菌和胞內分支桿菌的LAMP方法，靈敏度和PCR方法相當。Boehme等[16]也建立了LAMP方法用于設備簡陋的實驗室，樣品經過濾預處理，后面操作簡便，靈敏度和商用的核酸擴增試驗系統(tǒng)相當。

4.2 瘧疾（Malaria）LAMP檢測

瘧疾是嚴重威脅發(fā)展中國家兒童和孕婦健康的疾病之一?？焖贉蚀_檢測瘧原蟲對瘧疾的控制和預防是非常重要的。Han等[18]利用LAMP原理設計引物，能區(qū)分4種瘧原蟲，甚至到種的水平，靈敏度和專一性跟巢式PCR相似。Yamamura 等[25]發(fā)明了一種新的快速檢測惡性瘧原蟲的方法，其聯合了DNA 濾紙技術、環(huán)介導的等溫擴增技術和熔解曲線的分析技術，使瘧原蟲的檢出率更加精確，靈敏度、特異性分別為97.8%、85.7%。這些報告說明LAMP技術有望成為發(fā)展中國家瘧疾控制的有力工具。

LAMP技術除了用于TB和瘧疾的檢測外，還可用于另外一種發(fā)展中國家常見的病原菌艾滋病毒的檢測[2]。此外，LAMP還用于非洲錐蟲?。ɑ杷Y）的檢測[17]，這是常被忽略的熱帶病。所以快速準確的診斷是非常重要的。Kuboki等[21]首先將LAMP技術應用于檢測錐蟲,LAMP法能從1 pg總DNA 中成功擴增出布氏錐蟲基因,而傳統(tǒng)PCR 法在總DNA 樣本100 pg以上時才能檢測到陽性,前者比后者敏感度高100倍。針對不同靶基因的不同引物組合也成功地區(qū)分了岡比亞布氏錐蟲、克氏錐蟲、布氏錐蟲、伊氏錐蟲等4 種錐蟲。Njiru等[22]建立了檢測岡比亞錐蟲的LAMP試驗方法，靈敏度達到10個寄生蟲/mL血。他們利用重復插入移動因子序列作為靶標，成功檢出錐蟲屬亞屬，靈敏度高達0.001個寄生蟲/ mL血。

LAMP技術還可以用于其他傳染病的檢測如登革熱病毒[7]、埃博拉病毒[6]、乙肝病毒[9]等。至今還沒有足夠簡便、效率高、花費少并適合發(fā)展中國家基層實驗室通用的核酸擴增試驗系統(tǒng)。如上所說，LAMP試驗不需要精密溫度循環(huán)裝置, 所用設備簡單、花費少,有望發(fā)展成為最簡便的核酸擴增試驗系統(tǒng)，有利于從源頭控制疾病的傳播。

5 展望

最近一些新技術如芯片實驗室等[24]已發(fā)展和應用于分析科學的各個領域。芯片實驗室（Labon-a-chip）可以理解為把生物和化學等領域中所涉及的樣品制備、生物與化學反應、分離檢測等基本操作單位集成或基本集成于一塊幾平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化學反應過程，并對其產物進行分析的一種技術。盡管芯片實驗室的這種理念已應用于PCR方法[20]，但是LAMP方法的簡便、靈敏高等優(yōu)點有望使基于芯片實驗室的核酸檢測系統(tǒng)發(fā)展得更加便利。隨著相應診斷試劑盒的開發(fā)，LAMP有望成為一種簡易的常規(guī)檢測手段。LAMP是一種便捷、特異而又靈敏的基因檢測技術，進一步優(yōu)化、完善后將在遺傳病和傳染病的早期診斷方面有很大的應用潛力。

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