氣相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中1，3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯

馬小寧 田 燕 宋小莉 張鳳霞 賈 迪 李淑娟 仲維科 劉漢霞

（中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100123）

1 前言

嬰幼兒配方乳粉作為嬰幼兒主要的營養(yǎng)攝入來源，其營養(yǎng)成分和安全指標一直倍受關(guān)注。眾所周知，母乳是嬰兒的首選營養(yǎng)，因此，嬰幼兒配方乳粉也經(jīng)歷著逐步模仿和接近母乳的發(fā)展歷程。

嬰幼兒配方乳粉通常選用牛乳為原料，雖然牛乳的脂肪含量與母乳相似[1]，但其脂肪酸組成差異很大。為了滿足嬰幼兒的生長發(fā)育需求，以牛乳為基質(zhì)的嬰幼兒配方乳粉不斷發(fā)展變化，添加了γ-亞麻酸（C18：3）、花生四烯酸（C20：4）、α-亞麻酸（C18：3）、DHA（C22：6）等不飽和脂肪酸，使其更接近母乳的營養(yǎng)成分特征。棕櫚酸（C16:0）是人體最重要的產(chǎn)能脂肪酸，在甘油三酯上的位置分布對脂肪酸的消化和吸收有很大的影響[2-4]。牛乳脂肪中棕櫚酸的含量約為26 %，其中sn-2位上僅有32 %為棕櫚酸[5]；而母乳脂肪中棕櫚酸的含量為20 %-25 %，sn-2位上棕櫚酸含量約占總棕櫚酸的70 %[6]。許多研究證明，sn-2位棕櫚酸能夠提高脂肪酸的吸收利用率，促進嬰兒對脂肪[7-8]、礦物質(zhì)[8-10]的吸收，促進嬰兒骨骼礦物質(zhì)的沉積[4]、預防便秘。嬰幼兒配方奶粉中添加sn-2位棕櫚酸，可使其微觀上更接近母乳脂肪的成分，更容易被嬰幼兒消化吸收。

1,3-二油酸2-棕櫚酸甘油三酯（1,3-Dioleoyl 2-palmitoyl triglyceride；C52：2，簡稱OPO)是一種營養(yǎng)強化劑，屬于sn-2位棕櫚酸。OPO是以植物油為原料，在脂肪酶催化酯交換下，脂肪酸在丙三醇分子上的位置重新排列而得。它作為一種基本脂肪配料，模仿母乳的構(gòu)成和母乳脂肪的特性，從而能最佳地幫助鈣和能量的吸收[11]。2010年上海舉行的第六屆亞洲及太平洋地區(qū)母胎醫(yī)學大會上，眾多知名專家均認同配方奶粉引入OPO達到了迄今為止最為接近母乳的喂哺效果[12]。2008年中華人民共和國衛(wèi)生部第13號公告批準了OPO作為營養(yǎng)強化劑可用于嬰兒配方奶粉的生產(chǎn)，并于2010年中華人民共和國衛(wèi)生部第1號公告中明確了OPO擴大使用范圍及使用量。OPO被作為一種顯著有效的營養(yǎng)功能成分正在被廣泛的添加到嬰幼兒配方乳粉中，國際大型嬰幼兒配方乳粉生產(chǎn)企業(yè)爭相把“添加OPO”作為宣傳亮點，大量已經(jīng)添加“OPO”的嬰幼兒配方乳粉正在市場上流通。然而，國內(nèi)尚無任何關(guān)于OPO的檢測標準和檢測方法，無法衡量嬰幼兒配方乳粉中是否添加OPO，添加量如何以及添加范圍是否合理安全等問題。因此，亟待建立嬰幼兒配方乳粉中OPO定量檢測方法。

本研究建立了嬰幼兒配方乳粉中OPO含量的測定方法，旨在為保障嬰幼兒配方乳粉安全和質(zhì)量提供技術(shù)支持。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

78 90型氣相色譜儀：帶有多模式進樣口（MMI）及FID檢測器，Agilent公司；CP-TAP Ultimetal毛細管柱：25 m×0.25 mm×0.05 μm，Agilent公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELE。

2.1.2 試劑

OPO標準品：貨號D1657，純度≥99%，sigma公司；十七烷酸甘油三酯標準品：貨號T2151，純度≥99%，sigma公司；氦氣或氮氣：99.995 %，無有機物；氫氣：99.995 %，無有機物；空氣或氧氣：無有機物；正己烷：色譜純；氨水、酚酞、乙醇、乙醚、石油醚等：均為分析純。

2.2 方法

2.2.1 樣品處理

取樣品1-2 g于50 mL試管中，加入8 mL水，溶解后加2 mL氨水，充分搖勻；加入2滴酚酞指示劑，用氨水調(diào)溶液呈堿性，轉(zhuǎn)移至150 mL分液漏斗中，加10 mL乙醇搖勻；分兩次加入25 mL乙醚，分別搖勻；加入25 mL的石油醚，振蕩1min；靜置直至上層溶液澄清。重復以上步驟提取2次，將醚溶液合并至棕色圓底燒瓶中，在氮氣保護下45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

取100 mg提取出的油脂于10 mL容量瓶中，加入十七烷酸甘油三酯（C51:0）內(nèi)標溶液（3 mg/mL） 1 mL，加正己烷定容至刻度。轉(zhuǎn)移溶液至2 mL進樣瓶中。

2.2.2 標準溶液的配制

2.2.2.1 標準儲備溶液的配制

十七碳酸甘油三酯內(nèi)標溶液（3 mg/mL）：稱取30 mg十七碳酸甘油三酯標準物質(zhì)，用正己烷溶解并定容至10 mL。

OPO溶液（0.5 mg/mL）：稱取25 mg OPO標準物質(zhì)，用正己烷溶解并定容至50 mL。

2.2.2.2 混合標準工作溶液的配制

準確移取標準儲備液十七烷酸甘油三酯內(nèi)標溶液1 mL和OPO溶液9 mL于10 mL容量瓶中，即為混合標準溶液，其中十七烷酸甘油三酯內(nèi)標溶液濃度為300 μg/mL，OPO濃度為450 μg/mL。

2.2.3 色譜條件

進樣器溫度：70 ℃保持1 min，以50 ℃/min速度升溫至350 ℃保持25 min；

程序升溫：起始溫度70 ℃保持1 min，以50℃/min速度升溫至170 ℃后，再以20 ℃/min 速度升溫至350 ℃，保持25 min；

檢測器溫度：360 ℃；載氣：氦氣或氮氣，壓力約為15 psi；進樣量：1.0 μL。

2.2.4 色譜測定

取1.0 μL混合標準工作溶液注入氣相色譜儀，在2.2.3色譜條件下測定標準溶液的峰面積響應值，計算出相對響應因子。

取1.0 μL樣液注入氣相色譜儀，在2.2.3色譜條件下測定試樣的峰面積相應值，經(jīng)過與混合標準工作溶液譜圖比較響應值得到試樣中OPO的含量。

2.2.5 數(shù)據(jù)處理

2.2.5.1 計算相對響應因子

式中：

RFi—OPO的相對響應因子；

C51—混標中十七碳酸甘油三酯的濃度，單位為mg/mL；

A51—混標中十七碳酸甘油三酯峰面積；

Aopo—混標中OPO的峰面積；

Copo—混標中OPO的濃度，單位為mg/mL。

2.2.5.2 計算 OPO的含量

式中:

Xi—OPO在脂肪中的含量，單位為g/100g；

RFi—OPO的相對響應因子；

Aopo—樣品中OPO的峰面積；

Ac51—樣品中加入的內(nèi)標物十七碳酸甘油三酯峰面積；

Cc51—十七碳酸甘油三酯的濃度，單位為mg/mL；

Vc51—樣品中加入十七碳酸甘油三酯的體積，單位為mL；

m —試樣脂肪的質(zhì)量，單位為mg。

2.2.6 精密度與回收率實驗

按照2.2.3色譜條件連續(xù)進樣6次，通過RSD值來分析該儀器分析方法的精密度。分別向樣品中添加3個不同水平的OPO標準品，按上述實驗過程操作，每個水平重復試驗6次，通過RSD值來分析該方法的精密度，計算回收率。

2.2.7 實驗室間比對

本實驗室與合作實驗室對3個不同樣品（樣品1、2、3）按上述實驗過程操作，每個樣品重復測定6次檢測OPO含量，比較實驗室間的結(jié)果差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜柱選擇

本研究根據(jù)脂肪酸結(jié)構(gòu)性質(zhì)，選取適合脂肪酸分離的ZB-HT和CP-TAP兩種不同色譜柱，按照2.2.3色譜條件對同一樣品進行測定，研究兩種不同色譜柱針對分離C52系列同分異構(gòu)體的效果，結(jié)果見圖1。

圖1 兩種色譜柱對同一樣品針對C52出峰色譜圖

圖1 顯示，ZB-HT無法將碳原子數(shù)為52個的脂肪酸有效分離；CP-TAP能夠分離出4-5個C52系列同分異構(gòu)體，可以將OPO從C52系列脂肪酸中分離。

3.2 進樣器選擇

本研究對進樣口的選擇進行比較，使用同一型號色譜柱（CP-TAP）對同一標準品進行測定，分別使用普通分流/不分流進樣口和多模式進樣口（MMI）進行分離，結(jié)果見圖2。

圖2 使用不同進樣口對同一標準品出峰色譜圖

圖2 顯示，MMI進樣口相對于普通分流/不分流進樣口色譜峰峰形更好，MMI進樣口在冷不分流模式中，可以將進樣口溫度冷卻至低于樣品沸點的溫度，在樣品進樣過程中不會發(fā)生汽化，進樣口可根據(jù)程序加熱，使樣品汽化，并通過載氣將其傳送到色譜柱。與普通分流/不分流進樣口相比，MMI進樣口的主要優(yōu)點是分析物可以在較低的進樣口溫度下而不是在恒定的高溫下汽化，降低分析物熱裂解的可能性。

3.3 色譜條件優(yōu)化

氣相色譜儀中以柱溫、升溫程序的影響最大，在參考文獻及相關(guān)資料的基礎上[13]，研究最優(yōu)化升溫程序。首先進行了恒溫條件(a)試驗，以恒溫350 ℃保持40 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恒溫條件不適合OPO的分析，各組分出峰時間長且峰型差，不能得到較好的分離效果。采用一階升溫程序(b)分離，170 ℃保持1 min后以20 ℃/min速度升溫至350 ℃保持25 min；相較恒溫條件試驗，峰型雖然得到改善，但分離效果仍不理想，如圖3。采用二階升溫程序(c)進行條件優(yōu)化，70 ℃保持1 min后以50 ℃/min速度升溫至170 ℃，再以20 ℃/min速度升溫至350 ℃保持25 min，如圖4。

圖3 前處理后配方乳粉樣品在CP-TAP色譜柱使用(b)程序升溫條件的色譜圖

圖4 前處理后配方乳粉樣品在CP-TAP色譜柱使用(c)程序升溫條件的色譜圖

根據(jù)試驗結(jié)果，逐步進行優(yōu)化，最后得如下條件：

整個過程耗時37 min，使得配方乳粉中所有脂肪酸全部出峰，且C51與OPO分離效果良好。選擇較低的起始溫度，使得在程序升溫色譜分析時，多組分寬沸程混合物進樣后，由于蒸汽壓過低，大部分樣品溶解在固定相中，隨著柱溫越來越高，某些組分的蒸汽壓便帶動樣品移動至檢測器端，而柱溫越來越接近保留溫度，色譜帶增加的速度越快，從而對少數(shù)低沸點組分為最佳柱溫，得到良好分離效果[14]。

通過標準品及加標實驗可知，圖5中出峰時間為19min的是內(nèi)標，20.8min的是OPO。圖5還顯示，奶粉樣品中的C52系列組分集中在20min至23min之間出峰。通過本實驗中的色譜條件，C52系列的色譜峰可以很好的被分離開，并沒有重疊信號。這表明本方法適用于嬰幼兒配方乳品中OPO含量的測定。通過標準品色譜圖中的峰面積值，求得OPO與十七烷酸甘油三酯的相對響應因子RRFTG(OPO)=0.79。

圖5 配方乳粉中OPO的色譜圖

3.4 精密度與回收率

按本方法的色譜條件對同一樣品進行6次試驗，計算出OPO的含量后進行精密度分析，結(jié)果見表1，RSD值為2.93 %，表明儀器分析方法的重現(xiàn)性良好。

表1 精密度分析

向樣品中添加3個不同水平的OPO標準品，按上述實驗過程操作，每個水平重復試驗6次，結(jié)果見表2，回收率為92.4±4.5%。

表2 回收率測定結(jié)果

3.5 實驗室間比對

按本方法的實驗過程操作，同等色譜條件對3個不同樣品進行平行測定，計算出OPO的含量后進行實驗室間數(shù)據(jù)比對，所得結(jié)果見表3。

表3 不同實驗室間數(shù)據(jù)結(jié)果

表3顯示，實驗室A和B檢測結(jié)果基本一致，實驗室對同一水平檢測6次結(jié)果的平均值間的相對標準偏差（RSD）<5.0 %，表明方法的重現(xiàn)性良好。

4 結(jié)論

本研究采用氣相色譜法，建立了奶粉中OPO含量的測定方法，通過有機溶劑提取配方乳品中的脂肪酸，再以C51:0為內(nèi)標對OPO進行定量。

脂肪酸提取過程采用乙醚石油醚混合多次提取，以保證脂肪酸提取更加充分；MMI進樣器適合分析復雜基質(zhì)的樣品，對于分析食品萃取物，可以提高分析靈敏度，最大程度地減少熱不穩(wěn)定樣品的分解或降解，消除對一些化合物的針頭歧視現(xiàn)象；CP-TAP毛細管柱可以將C52系列脂肪酸分離，相對于其它色譜柱而言分離效果更好。

結(jié)果表明，本方法RSD為2.93%，重現(xiàn)性良好，回收率為92.4±4.5%，實驗室間比對結(jié)果一致，RSD <5.0 %。因此本方法準確可靠，可以對嬰幼兒配方乳粉中OPO的含量進行準確測定。

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［12］ 中外專家探討配方奶粉的重大創(chuàng)新突破 配方奶粉可以變得更易吸收.2010年11月11日14:04. 來源：人民網(wǎng)-健康衛(wèi)生頻道,http://health.people.com.cn/GB/13189069.html.

［13］ Triglycerides by Gas Chromatography, AOCS Official Method Ce 5-86 Reapproved 1997.

［14］ H M 麥克奈爾（美）.氣相色譜基礎[M]（第1版）.張家口：張家口市科學技術(shù)情報研究所，1979，181-183.