黃連解毒湯對(duì)大鼠急性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用1）

付曉春，陳建軍，王艦平

黃連解毒湯（HLJDT）源于唐·外臺(tái)秘要［1］，由黃連、黃柏、黃芩、梔子4味中藥構(gòu)成，近年來研究發(fā)現(xiàn)黃連解毒湯能明顯改善腦缺血損傷［2，3］，并且能顯著降低膽固醇，改善血栓及血液黏滯性［4］，提示黃連解毒湯對(duì)由于心肌缺血引起的心肌損傷具有保護(hù)作用。心肌損傷中的缺血再灌注損傷（I／R）是一個(gè)復(fù)雜的過程，研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷中起了非常重要的作用［5］，故本實(shí)驗(yàn)旨在觀察HLJDT在急性I／R過程中對(duì)血清腫瘤壞死因子（TNF－α）、白介素－1β（IL－1β）、肌酸激酶（CK）及NF－κB表達(dá)的影響，探討HLJDT在此過程中是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1．1 主要試劑 黃連解毒湯的制備：取黃連、梔子、黃柏、黃芩4味藥（1．5∶1．5∶1∶1）加水煮沸，合并3次藥液，恒溫100℃濃縮制成黃連解毒湯，每毫升含生藥5g。復(fù)方丹參片（FFDS）廣州白云山制藥總廠中藥廠，批號(hào)：090607）。實(shí)驗(yàn)中所用的緩沖液均由國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)試劑配制。TNF－α、IL－1ΒELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德。

1．2 動(dòng)物模型及分組 健康雄性SD大鼠56只，體重250g～300g，隨機(jī)等分為7組［6，7］，每組8只。假手術(shù)組、心肌缺血再灌注組，溶劑（1%CMC－Na）對(duì)照組；黃連解毒湯（HLJDT）高、中、低劑量組（200mg／kg、400mg／kg及800mg／kg），復(fù)方丹參組（500mg／kg）。連續(xù)給藥7d，缺血再灌注不作藥物處理，末次給藥24h后，腹腔注射戊巴比妥鈉4．5mg／100g，麻醉動(dòng)物后行氣管切開接微型呼吸機(jī)人工呼吸，呼吸頻率60次／min，潮氣量2mL／100g。沿胸骨左緣第4肋骨開胸在左心室、右心室與左心房交界處結(jié)扎／開放左冠狀動(dòng)脈前降支，建立心肌缺血再灌注模型。假手術(shù)組絲線穿過冠狀動(dòng)脈前降支但不結(jié)扎。30min后放開絲線恢復(fù)冠脈再通40min。

1．3 觀察指標(biāo)和檢測(cè)方法

1．3．1 血清 TNF－α、IL－1β、CK水平的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，股靜脈取血2mL，室溫靜置1h，后3000r／min離心5min，分離出血清，－80℃冰箱中保存。

1．3．2 心肌組織梗死區(qū)面積的測(cè)定 動(dòng)物缺血30min再灌注40min時(shí)，將左冠狀動(dòng)脈前降支重新結(jié)扎，經(jīng)舌靜脈注射0．5%伊文氏藍(lán)1．5mL，待缺血區(qū)清楚顯示后迅速取出心臟，用冰凍生理鹽水沖洗后剪除心房，－20℃冰凍10min，用心臟切片機(jī)垂直心臟長(zhǎng)軸將其切成1mm薄片（4～5）張，放入2mL氯化三苯基四氮（Sigma公司，美國(guó)）中37℃染色15min，用 HPIAS－2000圖像分析系統(tǒng)測(cè)定缺血區(qū)和壞死區(qū)面積，分別計(jì)算缺血區(qū)面積、梗死區(qū)面積占左心室面積的百分比。

1．3．2 用EMSA方法測(cè)定NF－κB的表達(dá) 取心尖以上梗死區(qū)心肌組織100mg放入1mL裂解緩沖液中（50mmol／LTrizol、100mmol／L二硫蘇糖醇、2%SDS，0．1%溴酚藍(lán)，10%的甘油）冰上勻漿30min，4℃12000g／min離心20min，取上清液，用Lowry法測(cè)定蛋白含量。取50μL樣品和等體積溴酚藍(lán)沸水煮3min，上樣進(jìn)行SDS－PAGE蛋白電泳，完后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，取出膜用BSA封閉，再用TSB－T溶液洗膜三次，加入兔抗大鼠NF－κBp65（Neomarkers公司，美國(guó)）孵育10h，用TSB－T溶液洗后加入羊抗兔IgG（KPL公司，美國(guó)）孵育2h，TSB－T溶液漂洗，最后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，將PVDF膜放入等體積配制的LumiGloAB發(fā)光液中，快速移至暗室，放在X光片下曝光顯影。掃描X光片，以灰度值表示NF－κB的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠TNF－α、IL－1β、CK水平 與假手術(shù)組比較，I／R組血清 TNF－α、IL－1β、CK明顯增高（P＜0．05）；與I／R組比較，HLJDT高中低劑量組、FFDS組血清 TNF－α、IL－1β、CK 降低。詳見表1。

表1 黃連解毒湯對(duì)大鼠I／R血清TNF－α、IL－1β、CK水平的影響（±s）

表1 黃連解毒湯對(duì)大鼠I／R血清TNF－α、IL－1β、CK水平的影響（±s）

與假手術(shù)組比較，1）P＜0．05；與I／R組比較，2）P＜0．05

組別 n 劑量（mg／kg） TNF－α／（ng／L） IL－1β（ng／L） CK（U／L）假手術(shù)組 8 － 73．06±14．79 38．13±10．79 684．2±41．2 I／R組 8 － 193．27±29．431） 95．62±19．311） 992．7±42．81）1%CMC－Na對(duì)照組 8 － 191．34±28．65 94．39±18．66 994．1±39．5 HLJDJN低劑量組 8 200 163．21±20．472） 80．27±18．452） 873．6±35．72）HLJDJN 中劑量組 8 400 127．15±19．592） 67．35±16．292） 804．3±32．92）HLJDJN高劑量組 8 800 101．32±17．732） 59．76±14．312） 786．5±36．42）復(fù)方丹參對(duì)照組 8 500 114．26±18．022） 62．33±15．282） 792．4±28．72）

2．2 心肌組織梗死區(qū)面積的測(cè)定 心肌缺血再灌注組的缺血面積明顯高于假手術(shù)組（P＜0．05），1%CMC－Na對(duì)照組，HLJDT低劑量組、HLJDT中劑量組缺血面積百分比與缺血再灌注組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HLJDT高劑量組、復(fù)方丹參組與缺血再灌注組及1%CMC－Na對(duì)照組比較缺血面積百分比均顯著減少（P＜0．05）。心肌缺血再灌注組的梗死面積明顯高于假手術(shù)組（P＜0．05），HLJDT低劑量組、中劑量組、HLJDT高劑量組、復(fù)方丹參組與缺血再灌注組及1%CMC－Na對(duì)照組比較梗死面積百分比均顯著減少（P＜0．05）。詳見表2。

2．3 用EMSA測(cè)定NF－κB的表達(dá)及活性 心肌缺血再灌注組NF－κB活性明顯高于假手術(shù)組（P＜0．05），1%CMC－Na對(duì)照組NF－κB活性與缺血再灌注組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HLJDT各劑量組、復(fù)方丹參組與缺血再灌注組及1%CMC－Na對(duì)照組比較NF－κB活性均顯著降低（P＜0．01）。詳見表2。

表2 黃連解毒湯對(duì)I／R心肌缺血面積、梗死面積的影響（±s）

表2 黃連解毒湯對(duì)I／R心肌缺血面積、梗死面積的影響（±s）

與假手術(shù)組比較，1）P＜0．05；與I／R組比較，2）P＜0．05；與1%CMC－Na對(duì)照組比較，3）P＜0．05

組別 n 劑量／（mg／kg） 缺血面積（%） 梗死面積（%） NF－κB假手術(shù)組 8 － 3．31±1．72 4．52±1．75 1．09±0．18 I／R組 8 － 41．52±2．311） 48．33±2．621） 3．92±0．531）1%CMC－Na對(duì)照組 8 － 43．81±1．76 46．35±4．18 3．87±0．28 HLJDT低劑量組 8 200 38．46±2．172）3） 35．70±3．342）3） 3．01±0．152）3）HLJDT 中劑量組 8 400 35．24±2．822）3） 28．43±2．452）3） 2．28±0．212）3）HLJDT高劑量組 8 800 30．78±1．832）3） 21．41±2．812）3） 1．69±0．132）3）復(fù)方丹參對(duì)照組 8 500 29．35±2．252）3） 23．28±3．022）3） 2．35±0．132）3）

3 討 論

心肌缺血再灌注時(shí)伴隨血漿炎性細(xì)胞因子及抗炎細(xì)胞因子的升高，其增高程度和心肌微循環(huán)的損傷程度有關(guān)，心肌組織水平灌注不良越嚴(yán)重，細(xì)胞因子升高越明顯［8］。炎癥細(xì)胞因子TNF－α、IL－1β的增加和缺氧均可激活 NF－κB，活化的 NF－κB迅速進(jìn)入核內(nèi)啟動(dòng)炎癥細(xì)胞因子、選擇素和黏附分子的表達(dá)，再升高的NF－κB等進(jìn)一步刺激NF－κB，形成正反饋，導(dǎo)致細(xì)胞因子水平不斷升高［9］。抑制NF－κB的激活在I／R引起的心肌損傷中可能起一定程度的保護(hù)作用［10］。缺血再灌注時(shí)劇增的氧自由基加重細(xì)胞膜的損傷，細(xì)胞內(nèi)CK釋放入血，引起相應(yīng)酶在血液中濃度升高，這些酶釋放入血的多少與心肌壞死程度呈正相關(guān)，故測(cè)定其血清含量被認(rèn)為有助于心肌缺血損傷程度的診斷。

本研究結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷時(shí)，TNF－α、IL－1β活性顯著升高，NF－κB表達(dá)增多，血清CK增加，心肌組織梗死面積增加；而 HLJDT處理后，TNF－α、IL－1β活性顯著降低，NF－κB表達(dá)降低，血清CK及心肌組織梗死面積降低，提示HLJDT通過抑制TNF－α、IL－1β釋放，并且抑制了下調(diào) NF－κB表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)，同時(shí)HLJDT抑制了血清CK的釋放并降低了心肌組織的梗死面積。

HLJDT對(duì)缺血再灌注心肌的保護(hù)作用可能與其抑制NF－κB的活性、減少促炎細(xì)胞因子的釋放、并減少血清CK的釋放有關(guān)。然而心肌缺血／再灌注損傷是一多渠道、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜病理生理過程，HLJDT對(duì)損傷的保護(hù)作用，其相應(yīng)機(jī)制以及臨床應(yīng)用價(jià)值，都有待進(jìn)一步深入系統(tǒng)的研究。

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