Alzheimer病和血管性癡呆患者APOE及LRP基因多態(tài)性與認(rèn)知及精神行為癥狀相關(guān)性研究

呂澤平 胡才友 周琴 楊澤 梁慶華 黃春麗 龐國防 楊秀塔

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，但目前很多研究認(rèn)為血管性危險(xiǎn)因素不僅與認(rèn)知損害和血管性癡呆（vascular dementia，VD）有關(guān)，也參與 AD的發(fā)生和發(fā)展，本文作者前期研究對(duì)部分心血管危險(xiǎn)因子與AD和 VD的關(guān)系進(jìn)行了探討［1－2］，本文進(jìn)一步對(duì)APOE、LRP基因多態(tài)性與AD和VD患者的認(rèn)知功能和精神行為癥狀 （behavioral and psychological symptoms of dementia，BPSD）相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 對(duì)象和方法

1.1 觀察對(duì)象 納入2002-05－2008-12廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院門診及住院的79例AD患者和85例VD患者，均為漢族，均符合美國神經(jīng)病學(xué)、語言機(jī)能障礙和卒中研究所以及AD和相關(guān)疾病協(xié)會(huì)及美國精神障礙診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版（NINCDS-ADRDA）的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。（1）AD組：男40例、女39例，年齡65～79歲，平均（72.8±9.5）歲；病程2.1～8.0年，病程中位數(shù)4年，均無AD的家族史。（2）VD組：男50例、女35例，年齡57～89歲，平均（73.9±8.9）歲；病程1.5～6.3年，病程中位數(shù)4.5年，均有動(dòng)脈粥樣硬化性腦血管病，無遺傳性血管病、缺血缺氧性腦病史。（3）健康對(duì)照組：156名，男92名、女64名，年齡62～80歲，平均（71.2±9.3）歲，均自廣西壯族自治區(qū)當(dāng)?shù)亟】禎h族老年人中隨機(jī)選取，均無腦血管病、糖尿病史，經(jīng)簡(jiǎn)易精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）和簡(jiǎn)明精神病量表（BPRS）檢查確定認(rèn)知行為功能正常。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 9700型PCR儀（ABI PE公司）、垂直電泳儀（北京六一儀器廠）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司產(chǎn)品）。蛋白酶E與Taq DNA聚合酶購自欣經(jīng)科生物技術(shù)公司，dATP、dCTP、dGTP和dTTP為Pharmacia公司產(chǎn)品，限制性內(nèi)切酶HhaⅠ和RsaⅠ均為Promega公司產(chǎn)品，HpaⅠ購自大連寶生物技術(shù)有限公司（日本Takara公司產(chǎn)品）。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提?。簾o菌收集納入的每個(gè)觀察對(duì)象靜脈血5mL，EDTANa2抗凝。按常規(guī)方法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA，用于進(jìn)行聚合 酶 鏈 式 反 應(yīng) （Polymerase Chain Reaction，PCR）。

1.3.2 APOE及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP）基因目的片段的PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定：分別按參考文獻(xiàn)［2］的限制性片段長度多態(tài)性聚 合 酶 鏈 反 應(yīng) （polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）方法進(jìn)行。根據(jù)APOE基因分型結(jié)果，將AD及VD組患者分別分為APOEε4攜帶者和APOEε4非攜帶者兩組：APOEε4攜帶者包括攜帶ε2／ε4、ε3／ε4 和 ε4／ε4 這 三 種 基 因 型 的 患 者；APOEε4非攜帶者包括攜帶ε2／ε2、ε2／ε3和ε3／ε3這三種基因型的患者。根據(jù)LRP基因分型結(jié)果，AD和VD組患者可分別分為LRP T攜帶者和LRP T非攜帶者兩組：LRP T攜帶者包括攜帶LRP C／T和T／T這兩種基因型患者；LRP T非攜帶者包括攜帶LRP C／C基因型的患者。

1.3.3 認(rèn)知功能及精神狀態(tài)評(píng)定：采用MMSE評(píng)定認(rèn)知功能。MMSE認(rèn)知功能障礙評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：文盲≤17分、小學(xué)≤20分、中學(xué)以上≤24分，總分0～30分。采用BPRS、漢密爾頓抑郁量表（HAMD，24項(xiàng)版本）、漢密爾頓焦慮量表（HAMA）調(diào)查全部AD患者的精神癥狀。按HAMD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：＜8分無抑郁，8～17分輕度抑郁，18～35分中度抑郁，＞35分重度抑郁。參照全國量表協(xié)作組提供的HAMA標(biāo)準(zhǔn)（1993年）：＜15分無焦慮，15～21分輕度焦慮，22～29分中度焦慮，＞29分重度焦慮。根據(jù)BPRS進(jìn)行精神病癥狀評(píng)定。以上量表評(píng)分均在正常范圍者為無BPSD組，凡有一項(xiàng)評(píng)定異常者均為BPSD組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析。對(duì)照組Hardy-Weinberg遺傳平衡定律吻合度檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)。二分類變量如基因型、等位基因頻率及有無BPSD在AD組和VD組內(nèi)比較或各組間比較均采用χ2檢驗(yàn)。連續(xù)型變量（如年齡及MMSE得分）均用±s表示，首先采用P－P圖觀察到數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，然后使用F檢驗(yàn)檢查顯示方差齊，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組APOE和LRP基因頻率分布 經(jīng)χ2檢驗(yàn)，對(duì)照組APOE基因和LRP基因的基因型頻率符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，P值分別為0.16和0.47。AD組及VD組APOEε4等位基因頻率均高于對(duì)照組（均P＜0.01），AD組和VD組APOEε3等位基因頻率均低于對(duì)照組（P＜0.01）（表 1）。與對(duì)照組相比，AD 和 VD 組APOEε2等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表1），LRP基因C、T等位基因頻率分布差異亦均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表2）。

表1 各組APOE基因型及等位基因頻率比較

表2 各組LRP基因型及等位基因頻率比較

表3 AD、VD患者不同APOE、LRP基因型MMSE評(píng)分及BPSD比較

2.2 不同基因型AD和VD組患者認(rèn)知功能比較AD組中1例患者未能檢測(cè)出LRP T攜帶情況。AD組APOEε4攜帶者M(jìn)MSE得分明顯低于APOEε4非攜帶者（P＜0.01），VD組 APOEε4攜帶者M(jìn)MSE得分明顯低于APOEε4非攜帶者（P＜0.01），AD和 VD組LRP T攜帶者 MMSE得分與LRP T非攜帶者M(jìn)MSE得分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

2.3 AD和VD組APOEε4攜帶者與APOEε4非攜帶者、LRP T攜帶者與LRP T非攜帶者BPSD比較 AD組患者APOEε4攜帶者BPSD比例明顯高于APOEε4非攜帶者，VD組患者APOEε4攜帶者BPSD比例與APOEε4非攜帶者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AD和VD組患者LRP T攜帶者BPSD比例與LRP T非攜帶者差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

3 討論

AD和VD是老年期癡呆中最常見的類型，兩者都可表現(xiàn)出認(rèn)知功能障礙、日常生活能力下降、精神行為癥狀。以往神經(jīng)科學(xué)界一直將二者嚴(yán)格區(qū)分開來。但近年來的研究顯示，微血管改變可能同樣是AD的基本病理改變，且與認(rèn)知功能下降有關(guān)，血管危險(xiǎn)因素增多可能導(dǎo)致AD的患病風(fēng)險(xiǎn)增高。1993年研究發(fā)現(xiàn)AD易感基因APOEε4等位基因，此基因型亦被確定為冠心病易感基因型，這無疑在生物學(xué)的角度為AD的“血管假說”提供了有力證據(jù)。APOE基因編碼產(chǎn)物是載脂蛋白apoE，該蛋白本身在腦內(nèi)具有神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)以及促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)作用。但是，APOE基因發(fā)生多態(tài)性變化時(shí)導(dǎo)致該基因編碼的載脂蛋白apoE的功能發(fā)生變化，甚至加劇AD樣病理改變，包括促進(jìn)老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成。其機(jī)制可能包括：（1）促進(jìn)纖維狀A(yù)β沉積；（2）影響星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ的清除；（3）促進(jìn)神經(jīng)原纖維纏結(jié)形成。另一些研究也發(fā)現(xiàn)LRP與Aβ的產(chǎn)生和清除有關(guān)，LRP基因的兩個(gè)常見多態(tài)性位點(diǎn)分別是5′端4核苷酸重復(fù)多態(tài)性和位于外顯子3內(nèi)的沉寂多態(tài)性（C766T）。其中5′端4核苷酸重復(fù)多態(tài)性與AD的相關(guān)性存在較多爭(zhēng)議，外顯子3部位的多態(tài)性與AD的相關(guān)性則已被幾個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室所證實(shí)［5－6］。本 研 究 中 作 者 發(fā) 現(xiàn)，AD 和 VD 組 的APOEε4等位基因頻率均高于對(duì)照組，并且AD和VD組APOEε4攜帶者 MMSE得分明顯低于APOEε4非攜帶者，提示兩者在發(fā)病機(jī)制上的某些共同性，與既往研究結(jié)果相似［7］。精神癥狀被認(rèn)為是癡呆的另一組核心癥狀，既往多數(shù)研究報(bào)道在AD患者中精神癥狀與APOEε4有顯著相關(guān)，VD的相關(guān)研究相對(duì)較少，本研究結(jié)果顯示AD組患者APOEε4攜帶者BPSD比例明顯高于APOEε4非攜帶者，而VD組患者APOEε4攜帶者BPSD比例與APOEε4非攜帶者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床上AD表現(xiàn)為廣泛認(rèn)知領(lǐng)域的障礙，這與AD患者廣泛的大腦皮層及邊緣系統(tǒng)出現(xiàn)萎縮、老年斑的沉積和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的病理相符。而VD主要為表現(xiàn)為波動(dòng)的、局灶性的認(rèn)知障礙，并且認(rèn)知障礙出現(xiàn)與否及嚴(yán)重程度與患者病灶的位置和嚴(yán)重情況有一定規(guī)律。而VD的精神癥狀是否更多的是與病灶的部位關(guān)聯(lián)，有待進(jìn)一步研究。本文結(jié)果顯示AD和VD組LRP基因C、T等位基因頻率分布與對(duì)照組比較，以及AD和VD組LRP T攜帶者M(jìn)MSE得分、BPSD比例與 LRP T非攜帶者M(jìn)MSE得分比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。過去解釋是LRP C766T多態(tài)性與AD發(fā)生無關(guān)時(shí)認(rèn)為LRP C766T多態(tài)性并不改變編碼產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)，僅是一種“靜態(tài)／沉寂”的核苷酸序列改變，因此LRP基因第3外顯子上的C766T沉寂多態(tài)性可能與AD的發(fā)生并無直接作用或相關(guān)性［2，7］。但在VD組中LRPC766T多態(tài)性與MMSE評(píng)分有差異的生物學(xué)意義，由于研究人群偏少，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，APOEε4可能是AD、VD患者認(rèn)知障礙的共同危險(xiǎn)因素。APOEε4可能是AD的BPSD危險(xiǎn)因素。

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