糞腸球菌的二氧化氯消毒試驗(yàn)

李榮光，何文杰，黃廷林，韓宏大，張?zhí)鹛?，孟憲獻(xiàn)

腸球菌是存在于人類或動(dòng)物胃腸道的正常菌群[1,2]。為革蘭氏陽(yáng)性球菌，需氧或兼性厭氧，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢，少數(shù)菌株有莢膜，觸酶試驗(yàn)陰性。自1984年以來(lái)，本菌屬已分離出至少19種基因型[3,4]，糞腸球菌（Enterococcus Faecalis）是其中的一種。腸道菌能通過(guò)飲用水傳播疾病，有效的消毒是保障飲用水安全的重要手段，通常以大腸桿菌為指示菌來(lái)評(píng)價(jià)消毒效果，但是只以一種細(xì)菌作為指示菌有很大的弊端，而目前腸球菌已被列入生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)附錄[5]，因此對(duì)腸球菌消毒效果的研究就顯得尤為重要。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)室配制的磷酸鹽緩沖液代替天然水進(jìn)行試驗(yàn)有利于避免混淆各水質(zhì)因素對(duì)消毒效果的影響，可以非常方便地調(diào)整各水質(zhì)因素（如pH、溫度）來(lái)研究它們對(duì)消毒效果的影響。大量的研究認(rèn)為反應(yīng)溫度和pH值對(duì)氯的消毒效果有重要影響[6-12]。pH值的變化會(huì)影響消毒劑水解的化學(xué)平衡，從而提高或降低消毒劑的活性；溫度的升高會(huì)增大消毒劑化學(xué)反應(yīng)的速率；有機(jī)物的加入不但會(huì)消耗消毒劑，而且會(huì)起到穩(wěn)定細(xì)菌的作用。

二氧化氯具有消毒能力強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，消毒副產(chǎn)物少的優(yōu)點(diǎn)也使其成為國(guó)際社會(huì)公認(rèn)的氯系列消毒劑最理想的換代產(chǎn)品[13-15]。在美國(guó)有400多家水廠、歐洲有數(shù)千家水廠應(yīng)用二氧化氯消毒[16]。在我國(guó)小規(guī)模的給水廠中亦有應(yīng)用[17]，并且在農(nóng)村也有應(yīng)用[18]。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 消毒劑

二氧化氯試劑通過(guò)稀釋2%的穩(wěn)定性二氧化氯獲得。消毒劑在每次使用前標(biāo)定濃度。使用N－二乙基對(duì)苯二胺（DPD）法對(duì)消毒劑進(jìn)行檢測(cè)，所用儀器為Pocket ColorimeterTMⅡ 二氧化氯檢測(cè)儀（美國(guó)HACH公司）。

1.2 磷酸鹽緩沖液（PBS）和菌懸液

磷酸鹽緩沖液用0.1 mol/L的磷酸氫二鈉和0.1 mol/L的無(wú)水磷酸二氫鈉制備，調(diào)節(jié)pH為6、7.5和9（除pH影響消毒效果的研究外，其余試驗(yàn)均在pH=7.6±0.1的條件下進(jìn)行）。

試驗(yàn)所用菌種為美國(guó)典型菌種保藏中心提供的糞腸球菌（ATCC19433）。菌懸液的制?。河? mL的生理鹽水將斜面上的細(xì)菌洗脫下來(lái)，加到營(yíng)養(yǎng)肉湯中于37℃培養(yǎng)24 h到穩(wěn)定期，再注入經(jīng)121℃滅菌的離心管中于4 000 r/min下離心10 min，棄掉上清液并用相同體積的PBS清洗離心管底部的沉淀物，再次放入離心機(jī)在相同條件下離心，后用10 mL的PBS對(duì)細(xì)菌進(jìn)行重懸，試驗(yàn)時(shí)將其稀釋到所需濃度。

1.3 試驗(yàn)方法

取上述菌懸液1 mL加到盛有100 mL PBS的三角瓶中，加入消毒劑并用磁力攪拌器在400 r/min下進(jìn)行緩慢攪拌。在預(yù)先設(shè)定的反應(yīng)時(shí)間分別取出1 mL的水樣加入到9 mL帶有硫代硫酸鈉中和劑的生理鹽水中，稀釋后用平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)[19]。

在進(jìn)行溫度影響的試驗(yàn)時(shí)，將盛有試驗(yàn)溶液的三角瓶放置在恒溫水浴鍋中，調(diào)節(jié)到試驗(yàn)所需溫度，待溫度恒定后，再加入消毒劑進(jìn)行滅菌試驗(yàn)。

采用甘氨酸和腐植酸分別代表低分子量和高分子量有機(jī)物進(jìn)行試驗(yàn)。取1 g甘氨酸加入到1 L經(jīng)滅菌的去離子水中，配制成濃度為1 g/L的儲(chǔ)備液。取1g腐植酸加到1 L經(jīng)滅菌的去離子水中，使用0.1 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH到12，待腐植酸溶解后，再用0.1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)溶液pH到7.6左右，配制成濃度為1 g/L的儲(chǔ)備液，并測(cè)定上述兩種溶液的TOC值。使用時(shí)將溶液稀釋到所需濃度。

1.4 數(shù)據(jù)擬合

數(shù)據(jù)擬合用Chick－Watson模型：

式中N——反應(yīng)時(shí)間t時(shí)的存活細(xì)菌數(shù)，cfu/mL；

N0——反應(yīng)時(shí)間0時(shí)的存活細(xì)菌數(shù)，cfu/mL；

k——反應(yīng)速率常數(shù)，L/mg·min；

C——反應(yīng)時(shí)間t時(shí)的消毒劑濃度，mg/L；

t——反應(yīng)時(shí)間，min。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 pH值的影響

pH值對(duì)二氧化氯滅活糞腸球菌的影響如圖1所示。

圖1 pH值對(duì)二氧化氯滅活糞腸球菌的影響Fig.1 Effect of pH on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

由1圖可知在pH為6～9的范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，滅活速率逐漸變大，達(dá)到3log所需的Ct值在pH=9時(shí)比pH=6時(shí)的少48%。這與pH值對(duì)自由氯滅活細(xì)菌病毒的情況恰好相反。出現(xiàn)這種情況的原因可能是由于二氧化氯對(duì)細(xì)菌滅活的機(jī)理不同于自由氯，自由氯是溶于水后產(chǎn)生的次氯酸起作用，次氯酸呈酸性，所以低pH條件有利于自由氯滅活，而二氧化氯是通過(guò)單質(zhì)分子的作用對(duì)細(xì)菌起到滅活效果，高pH值條件下產(chǎn)生的氫氧根離子可能對(duì)整個(gè)滅活過(guò)程起到了催化作用[20]。此外在pH值為7.5～9之間，滅活分為兩個(gè)階段：開(kāi)始快速的滅活期和后期速率較慢的拖尾期。這與先前的研究者們經(jīng)常觀察到的生存曲線首先是一個(gè)指數(shù)的動(dòng)力學(xué)接著是存活菌數(shù)量恒定或緩慢減少的拖尾現(xiàn)象的情況一致[21]。

2.2 溫度的影響

溫度對(duì)二氧化氯滅活糞腸球菌的影響如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)二氧化氯滅活糞腸球菌的影響Fig.2 Effect of Temperatrue on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine dioxide

由2圖可知隨著溫度的升高，二氧化氯的滅活速率逐漸變大。溫度在由8℃提高到35℃時(shí)，達(dá)到3log所需的Ct值由 1.8 降低到 0.59 mg·min/L，減少了大約1/3倍。

溫度對(duì)滅活速率常數(shù)的影響如圖3所示。

圖3 溫度對(duì)二氧化氯滅活糞腸球菌反應(yīng)速率常數(shù)的影響Fig.3 Effect of Temperatrue on Rate Constants for Inactivation ofEnterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

根據(jù)阿倫尼烏斯公式：

式中：k——反應(yīng)速率常數(shù)，L/mg·min；

A——頻率因子；L/mg·min；

Ea——活化能，J/mol；

R——?dú)怏w常數(shù)，8.314 J/mol·K；

T——絕對(duì)溫度，K。

將滅活速率常數(shù)k的自然對(duì)數(shù)（lnk）與溫度的倒數(shù)（1/T）作圖，由最小二乘法得出參數(shù)A=1.8×106 L/mg·min，二氧化氯滅活糞腸球菌的活化能Ea=30 396 J/mol，此結(jié)果小于臭氧滅活枯草桿菌的Ea=46 820 J/mol值[22]。

2.3 有機(jī)物的影響

有機(jī)物對(duì)二氧化氯滅活糞腸球菌的影響如圖4所示。

圖4 有機(jī)物對(duì)二氧化氯滅活糞腸球菌的影響Fig.4 Effect of Organic Matters on Inactivation of Enterococcus Faecalis with Chlorine Dioxide

試驗(yàn)時(shí)所投加的甘氨酸和腐植酸的TOC濃度均為0.4 mg/L。由圖4可知當(dāng)不存在有機(jī)物時(shí)，二氧化氯對(duì)糞腸球菌的滅活規(guī)律按照Chick-Watson定律進(jìn)行。而當(dāng)存在有機(jī)物時(shí)，滅活規(guī)律表現(xiàn)為一個(gè)快速的假一級(jí)動(dòng)力學(xué)滅活，達(dá)到一定的滅活率時(shí)，出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象。投加甘氨酸和腐植酸后，二氧化氯對(duì)糞腸球菌的滅活效果明顯下降，達(dá)到3log去除率所需的Ct值由1.22分別提高到1.84和3.58 mg·min/L，提高了 51%和近 2 倍。

此外在相同的TOC濃度下，代表大分子量的腐植酸對(duì)二氧化氯滅活糞腸球菌的影響大于同濃度下的甘氨酸，分析可能是因?yàn)槎趸仍谂c大分子量的腐植酸反應(yīng)時(shí)，將其氧化分解為小分子量的中間產(chǎn)物，而二氧化氯還可繼續(xù)與這些中間產(chǎn)物反應(yīng)，直到二氧化氯的剩余濃度為0或者是生成了最終產(chǎn)物為止，從而造成了腐植酸對(duì)滅活效果的反作用大于小分子量的甘氨酸。

3 結(jié)論

（1）與pH值對(duì)自由氯滅活細(xì)菌的影響情況恰好相反，隨著pH值的增加，二氧化氯的滅活速率逐漸變大，pH=9時(shí)達(dá)到3log所需的Ct值比pH=6時(shí)的少48%。

（2）在8～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，二氧化氯的滅活速率逐漸變大。且溫度對(duì)滅活速率常數(shù)的影響符合阿倫尼烏斯定律。

（3）有機(jī)物的加入降低了二氧化氯對(duì)糞腸球菌的滅活速率，并且大分子量的腐植酸的的影響要大于小分子量的甘氨酸。

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