麻花秦艽種子休眠機(jī)理及其破除方法

李兵兵，魏小紅，* ，徐 嚴(yán)，2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070;2.郴州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，郴州 423042)

種子休眠是植物適應(yīng)環(huán)境的繁殖策略之一，但往往給實(shí)際生產(chǎn)中帶來不便。因此，研究生產(chǎn)中如何破除種子休眠，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。近年來，國內(nèi)外對打破種子休眠和提高種子發(fā)芽率的方法已有大量報到，如變溫和冷濕層積等因素有利于打破苔草(Carex)種子的休眠［1］;利用外源赤霉素處理擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子及赤霉素結(jié)合機(jī)械處理宮燈百合(Sandersonia aurantiaca)種子均能提高種子的發(fā)芽率［2-3］;鄭蔚虹等［4］通過采用青霉素、過氧化氫和高錳酸鉀浸種沙棘(Hippohae rhamnoides)種子，結(jié)果顯示3%過氧化氫、250 mg/L青霉素和0.15%高錳酸鉀浸種能夠顯著提高種子的活力，促進(jìn)種子萌發(fā)及幼苗生長;于曉等［5］認(rèn)為延長儲藏時間和劃破種皮均能顯著提高鹽生草(Halogeton glomeratus)種子的萌發(fā)率。另外，有關(guān)植物種子休眠原因也有大量報道，如Pérez-García等［6］對半日花(Helianthemum soongoricum)種子進(jìn)行不同的處理，結(jié)果表明人工去種皮的種子發(fā)芽率最高，種皮不透性是造成其休眠的主要原因。王艷華等［7］研究了大山櫻(Prunus sargentii)種子種胚、內(nèi)種皮和外種皮浸提液對白菜籽萌發(fā)的影響，結(jié)果表明內(nèi)源抑制物是大山櫻種子休眠的因素之一。Debeaujon等［8］指出，胚的生理休眠主要是抑制劑如脫落酸(abscisic acid，ABA)濃度過高，而促進(jìn)劑如赤霉素(gibberellin acid，GA)等濃度過低所致。楊期和等［9］論述了胚休眠可以是形態(tài)的、生理的或二者兼而有之。

秦艽是我國三級重點(diǎn)保護(hù)野生藥材之一，有大葉秦艽(Gentiana macrophylla Pall.)、麻花秦艽(G．straminea Maxim.)、粗莖秦艽(G．crassicaulis Duthie ex Burk.)和小秦艽(G．dahurica Fisch.)等。秦艽種子因存在休眠問題、發(fā)芽速率慢、出苗不齊整以及當(dāng)年種子發(fā)芽率僅為20%左右，給秦艽的大規(guī)模生產(chǎn)栽培帶來極大不便。關(guān)于提高秦艽種子發(fā)芽的相關(guān)研究已有報道，如劉麗莎等［10］和滕紅梅等［11］利用赤霉素浸泡秦艽種子，20℃培養(yǎng)后均極大提高了種子發(fā)芽率，但秦艽種子休眠原因和破除休眠方法的研究鮮有報道。本文選用麻花秦艽種子作為研究材料，深入系統(tǒng)地探討其休眠機(jī)制和打破休眠的方法，為人工馴化和大規(guī)模生產(chǎn)栽培提供理論和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為麻花秦艽種子。2010年11月采集于甘肅省隴西市首陽鎮(zhèn)，通風(fēng)后熟干燥貯藏。種子呈圓形、橢圓形，表皮呈紅褐色，凈度分析后過40目篩，取飽滿、均勻一致的顆粒。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與測定方法

1.2.1 麻花秦艽種子透水性

取2 g種子，分別在天平(1/10000)上精確稱量后放入50 mL燒杯中，于蒸餾水中20℃恒溫浸泡，每隔2 h取出種子，擦干后準(zhǔn)確稱重，直至36 h結(jié)束。計(jì)算種子吸水率，重復(fù)3次:

1.2.2 麻花秦艽種子粗提物的制備及活性測定

(1)種子粗提物制備 采用浸提法，參考趙敏等［12］的方法。稱取麻花秦艽種子20 g在研缽中研碎，加3倍體積水，置于56℃下浸提24 h。過濾后殘?jiān)俳?次，每次浸提12 h，合并3次浸提液，56℃下濃縮成100 mL，即濃度為0.2 g/mL粗提物溶液。

(2)粗提物對小麥生長的影響 參考趙敏等［12］的方法，設(shè)置粗提物濃度為0(對照)、0.08、0.12和0.16 g/mL，于有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中加入6 mL的粗提物溶液，(28±1)℃培養(yǎng)皿(d=90 mm)黑暗中培養(yǎng)。24 h后統(tǒng)計(jì)和計(jì)算處理組發(fā)芽率、地上部分和地下部分的長度以及葉綠素含量分別為對照的百分率。葉綠素的含量測定參照鄒琦的方法［13］。

(3)粗提物對白菜萌發(fā)的影響 參考趙敏等［12］的方法，設(shè)置濃度為0(對照)、0.02、0.04、0.08、0.12和0.16 g/mL，加入6 mL的粗提物溶液，(24±1)℃培養(yǎng)皿黑暗中培養(yǎng)，保持培養(yǎng)皿濕潤，24 h測定發(fā)芽率，48 h測量根長，并計(jì)算內(nèi)源抑制物活性:

(4)粗提物對自身種子萌發(fā)的影響 麻花秦艽種子用10%氯化汞溶液消毒5 min，于蒸餾水中浸泡24 h后置于雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每培養(yǎng)皿50粒(隨機(jī)選取)，每處理4個重復(fù)，20℃恒溫黑暗培養(yǎng)。設(shè)置粗提物濃度為0.05、0.1、0.15和0.2 g/mL，向培養(yǎng)皿中加入不同濃度6 mL的粗提物溶液，稱重法保持培養(yǎng)皿濕潤，培養(yǎng)14 d后結(jié)束種子萌發(fā)試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率，測量根長。以上所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 破除麻花秦艽種子休眠的方法

將消毒的麻花秦艽種子在蒸餾水中浸泡24 h后，作如下處理:①對照處理;②20℃流水浸泡24 h;③500 mg/L赤霉素(GA3)和青霉素(penicillin，醫(yī)用注射)溶液浸泡24 h;④高錳酸鉀(KMnO4)溶液，濃度為1.5%浸泡10 min;⑤1 mol/L硫酸(H2SO4)浸泡40 min。浸泡完成倒去溶液，用蒸餾水沖洗，置于雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿50粒(隨機(jī)選取)，每處理重復(fù)4次，同一時間段培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中20℃恒溫培養(yǎng)，其中KMnO4處理為光照培養(yǎng)，其它處理為黑暗培養(yǎng)。保持培養(yǎng)皿濕潤，每天進(jìn)行觀測，第8天測定發(fā)芽勢(GP)，第14天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率(GR)、發(fā)芽指數(shù)(GI)和活力指數(shù)(VI)，測量根長。

其中，Gt為發(fā)芽后第t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為Gt對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

1.2.4 抑制物清除

各取20 g麻花秦艽種子，消毒，40 mL蒸餾水中浸泡24 h后，作如下處理:40 mL 500 mg/L赤霉素浸泡24 h、40 mL 1.5%高錳酸鉀浸泡10 min和不做任何處理。處理完成后參照1.2.2制備種子粗提物及其活性測定。設(shè)置粗提物的濃度為0(對照)、0.02、0.04、0.08、0.12和0.16 g/mL，用白菜作生物測定，24 h后測定發(fā)芽率，計(jì)算處理組發(fā)芽率為對照發(fā)芽率的百分率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS18.0和Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制，用Duncan法對上述指標(biāo)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 麻花秦艽種子的透水性

圖1表明20℃時麻花秦艽種子的吸水率隨浸種時間的延長呈拋物線型變化，由其可知種子20℃時吸水過程符合Logistic曲線方程。利用Logistic曲線方程直線化擬合結(jié)果及估算的各參數(shù)見圖2和表1，吸水率對應(yīng)浸種時間的Logistic直線化方程為y'=0.8827-0.4034x(R2=0.9777，P＜0.01)?？芍?，20℃時2 g麻花秦艽種子浸水后立即吸脹，浸種2.19 h吸水速度最快，為急劇吸水期;浸種5.45 h后吸脹高峰結(jié)束，進(jìn)入穩(wěn)定吸水期;至浸種8.13 h后吸脹結(jié)束為吸水飽和期，最大速率為28.72 g/h。表明麻花秦艽種子透水性良好，種胚能快速吸收足夠的水分。因此，推斷種皮透性水不是引起麻花秦艽種子休眠的原因。

圖1 20℃麻花秦艽種子吸水率隨浸泡時間的變化Fig．1 Changes of water absorption of G．straminea Maxim．seed to soaking time under 20℃

圖2 20℃下麻花秦艽種子吸水率與浸種時間配合Logistic方程直線化擬合結(jié)果(n=11×3)Fig．2 Linear response of water absorption of G．straminea Maxim．seed to soaking time based on Logistic equation under 20℃

表1 麻花秦艽種子吸水率與浸種時間配合Logistic方程估計(jì)的參數(shù)Table 1 The estimated parameters based on Logistic equation fitting soaking rate with soaking duration in G．straminea Maxim

2.2 麻花秦艽種子粗提物的生物活性研究

2.2.1 種子粗提物對小麥生長的影響

粗提物對小麥種子的發(fā)芽率及地上部分和地下部分的生長均有明顯的抑制作用，且隨著其濃度增大，抑制作用顯著增強(qiáng)(表2)。粗提物濃度為0.16 g/mL時，小麥種子發(fā)芽率、地上部分和地下部分的長度分別較0.08 g/mL極顯著降低37.61%、30.09%和42.67%(P＜0.01)，其中對小麥地下部分生長抑制作用最強(qiáng)，說明麻花秦艽種子中可能存在內(nèi)源抑制物，對小麥種子萌發(fā)及幼苗生長有明顯抑制作用。但不同濃度粗提物作用下小麥葉綠素含量為對照組的百分率之間差異不顯著，說明粗提物雖然對小麥幼苗生長產(chǎn)生抑制，但未干擾葉綠素合成。

2.2.2 種子粗提物對白菜萌發(fā)的影響

隨著粗提物濃度的增大，內(nèi)源抑制物的活性則越大，對白菜種子發(fā)芽率和根的抑制作用越強(qiáng)，表明粗提物對白菜種子的萌發(fā)有明顯的抑制作用(圖3)。當(dāng)濃度為0.02 g/mL時，抑制活性最低;當(dāng)濃度達(dá)0.16 g/mL時，抑制活性最強(qiáng)，后者較前者對發(fā)芽率和根長的抑制活性分別極顯著提高342.13%、66.14%。進(jìn)一步說明了麻花秦艽種子存在影響種子萌發(fā)的內(nèi)源抑制物。

表2 麻花秦艽種子粗提物對小麥種子萌發(fā)和幼苗的影響Table 2 Effect of crude extract from G．straminea Maxim．seeds on germination and seedling of wheat

2.2.3 種子粗提物對種子自身萌發(fā)的影響

粗提物對自身種子的萌發(fā)和幼苗有著明顯的抑制作用(表3)。隨著粗提物濃度的增大，發(fā)芽率和根長與對照相比，其比率(%)均有所降低。當(dāng)濃度為0.05 g/mL時其發(fā)芽率與根長為對照的百分率最大，較0.2 g/mL濃度的發(fā)芽率和根長為對照的百分率極顯著降低，分別降低47.70%和61.11%。發(fā)芽率為對照的百分率隨濃度的增大而遞減，而粗提物濃度為0.15 g/mL時，根長為對照的百分率最低為52.94%。更進(jìn)一步說明麻花秦艽種子存在內(nèi)源抑制物。

圖3 麻花秦艽種子粗提物對白菜萌發(fā)和根長的影響Fig．3 Effect of crude extract from G．straminea Maxim．seeds on germination and radicle growth of cabbage

2.3 不同處理對麻花秦艽種子萌發(fā)的影響

采用1.5%高錳酸鉀和500 mg/L赤霉素等處理對麻花秦艽種子破除休眠進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，適宜的處理對麻花秦艽種子萌發(fā)有促進(jìn)作用，均可打破麻花秦艽種子的休眠(表4)，處理種子最早在第5天發(fā)芽，比對照提前2 d。1.5%高錳酸鉀處理發(fā)芽率最高，達(dá)90%，與流水浸泡、500 mg/L青霉素和對照比對差異極顯著，分別提高45.16%、20%和106.90%;比1 mol/L硫酸處理，發(fā)芽率顯著提高9.76%(P＜0.05);但與500 mg/L赤霉素處理比較，發(fā)芽率僅提高了7.78%，差異不顯著。

由表4可知，1.5%高錳酸鉀處理麻花秦艽種子發(fā)芽勢較流水浸種、500 mg/L青霉素和對照極顯著提高435.29%、121.95%和521.43%，較1 mol/L硫酸和500 mg/L赤霉素顯著提高24.08%、35.82%;發(fā)芽指數(shù)較流水浸種、500 mg/L青霉素和對照極顯著提高158.00%、78.10%、和266.71%，較1 mol/L硫酸和500 mg/L赤霉素顯著提高24.04%、19.94%;活力指數(shù)較流水浸種、500 mg/L青霉素、對照、1 mol/L硫酸和500 mg/L赤霉素均分別極顯著提高364.33%、251.00%、709.66%、111.76%、85.11%。發(fā)芽活力可以反映種子萌發(fā)動力，發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢均可揭示種子萌發(fā)的速度和整齊度。因此，1.5%高錳酸鉀光照培養(yǎng)發(fā)芽質(zhì)量最佳。

表3 麻花秦艽種子粗提物對麻花秦艽種子發(fā)芽的影響Table 3 Effects of crude extracts from G．straminea Maxim seeds on germination of G．straminea Maxim．

表4 不同處理麻花秦艽種子的發(fā)芽特性Table 4 Germinative characteristics of G．straminea Maxim．seeds under different treatment

2.4 高錳酸鉀和赤霉素處理后麻花秦艽種子內(nèi)源抑制物的變化

采用高錳酸鉀和赤霉素處理的麻花秦艽種子制備的粗提物，對白菜種子進(jìn)行生物活性分析，圖4顯示，該粗提物依然對白菜種子萌發(fā)及幼苗生長具有抑制作用，且隨著濃度的增大，抑制作用也隨之增強(qiáng)。經(jīng)高錳酸鉀處理的不同濃度粗提物培養(yǎng)的白菜種子，其發(fā)芽率為對照發(fā)芽率的百分率均高于未處理，說明高錳酸鉀處理的種子其粗提物抑制作用均低于未處理，尤其濃度為0.02 g/mL時，其發(fā)芽率與對照發(fā)芽率比值較未處理顯著提高了26.33%。當(dāng)濃度為0.08—0.16 g/mL時，經(jīng)赤霉素處理的種子其粗提物抑制作用明顯強(qiáng)于未處理種子;當(dāng)濃度為0.02—0.04 g/mL時，抑制作用顯著低于未處理，說明赤霉素處理可能導(dǎo)致種子內(nèi)源抑制物的增加。濃度為0.02 g/mL的赤霉素處理的種子粗提物培養(yǎng)的白菜種子，其發(fā)芽率為對照發(fā)芽率的百分率較未處理顯著提高了18.40%，這可能是粗提物濃度較低，而赤霉素促進(jìn)了白菜種子的萌發(fā)。因此，高錳酸鉀處理減弱了麻花秦艽種子內(nèi)源抑制物的活性。

圖4 不同處理的麻花秦艽種子粗提物對白菜萌發(fā)的影響Fig．4 Effect of crude extract from G．straminea Maxim．seeds of different treatment on germination of cabbage

3 討論

3.1 影響麻花秦艽種子休眠的主要因素

本試驗(yàn)供試種子為當(dāng)年采收，干燥貯藏后熟，于2011年3月份實(shí)驗(yàn)。本研究中，1)20℃時麻花秦艽種子浸種2.19 h后吸水速率最大為62.84%，8.13 h后吸水飽和，其吸水過程所表現(xiàn)的3個階段，符合種子的吸水規(guī)律，說明麻花秦艽種皮對種子吸水無阻礙作用。秦艽喜生長在雨水充足，氣候冷涼，光照充足的高山地區(qū)，20℃是秦艽種子最適發(fā)芽溫度［10-11］，此時麻花秦艽呈現(xiàn)的無阻礙吸水是環(huán)境選擇的結(jié)果。2)經(jīng)1.5%高錳酸鉀和1 mol/L硫酸處理腐蝕的麻花秦艽種子均打破了休眠，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)各指標(biāo)均極顯著高于對照，表明麻花秦艽種皮存在著機(jī)械障礙，這與溪蓀(Iris sanguinea)［14］的研究結(jié)果相似。3)流水浸泡可提高麻花秦艽種子的發(fā)芽率，說明種子內(nèi)可能含有萌發(fā)抑制物，這與趙敏等［12］報道膜莢黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge］溫水浸種的結(jié)果相似;同樣其種子粗提物對小麥和白菜萌發(fā)和生長具有明顯的抑制作用，也說明麻花秦艽種子內(nèi)含萌發(fā)抑制物;另外，這些粗提物對麻花秦艽種子自身萌發(fā)也產(chǎn)生了較強(qiáng)的抑制作用，更證明了這一點(diǎn)。正如Debeaujon等［8］指出，胚的生理休眠主要是因?yàn)槭且种苿舛冗^高，而促進(jìn)劑濃度過低所致。趙敏等［12］對膜莢黃芪［Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge］內(nèi)源抑制物的研究結(jié)果表明膜莢黃芪存在內(nèi)源抑制物。Amritphale等［15］指出，葫蘆科(Cucurbitaceae)種子外胚乳中存在的抑制物質(zhì)ABA能夠通過抑制β-1，3-葡聚糖酶的表達(dá)影響外胚乳中內(nèi)含物的代謝，從而抑制珠孔端胚乳的降解與破裂，延緩種子的萌發(fā)。喻梅等［16］研究野生鴨兒芹(Cryptotaenia japonica)種子休眠及破除方法，研究結(jié)果表明內(nèi)源抑制物是種子休眠的原因之一，清水浸種和低溫冷藏共同處理可有效解除其休眠?？芍呀?jīng)完成后熟的麻花秦艽種子的休眠屬于綜合休眠(combinational dormancy，PY+PD)［17］，即種皮機(jī)械障礙和內(nèi)源抑制物是影響麻花秦艽種子休眠的主要因素。種子休眠是調(diào)節(jié)萌發(fā)最佳時間和空間分布的一個方法，具有極其重要的生態(tài)學(xué)意義［9］，例如時間分布是通過擴(kuò)大萌發(fā)時期來實(shí)現(xiàn)的，如滕紅梅等試驗(yàn)結(jié)果顯示秦艽種子80多天后仍有發(fā)芽［11］，有利于種的生活和傳播。在不同生境中，及不同空間上也有差異，如低溫打破種子休眠則在氣候溫暖的地區(qū)很難萌發(fā)，而且光敏性強(qiáng)的種子，在陽光照射不到的地方不足以解除休眠。而秦艽生長在海拔較高地區(qū)，喜冷涼氣候。因此，麻花秦艽種子的綜合休眠是生態(tài)環(huán)境選擇的生存方式，可使之與外界環(huán)境相適應(yīng)。

3.2 破除麻花秦艽種子休眠的處理

種子休眠是植物對外界自然環(huán)境的一種適應(yīng)性行為，能夠防止種子在不適宜的環(huán)境中萌發(fā)。但在生產(chǎn)上需要種子快速、整齊的發(fā)芽，來滿足生產(chǎn)的實(shí)際需要。一些研究表明，高錳酸鉀、赤霉素、青霉素、硫酸處理均可以打破種子休眠［4，18-21］，促進(jìn)種子萌發(fā)。高錳酸鉀和硫酸處理可以腐蝕和氧化種皮，也可以氧化種皮中含有的可以抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)，同時又打破了胚發(fā)育時種皮的機(jī)械阻力，增加透水性、透氣性，從而打破種子休眠［4，18］。赤霉素增強(qiáng)了α-淀粉酶的mRNA轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致α-淀粉酶［19］合成增加，加強(qiáng)了種子有氧呼吸，加大胚的生長速度，提高了種子的發(fā)芽率。青霉素亦有誘導(dǎo)植物α-淀粉酶形成和促進(jìn)生長等作用，類似于生長素、赤霉素和細(xì)胞分裂素［20-21］。麻花秦艽種子采摘后需通風(fēng)后熟處理5—7 d，干燥貯藏，自然條件下雖種子生活力高達(dá)94.3%，但發(fā)芽率僅為20%，可知種子處于休眠狀態(tài)。根據(jù)前期的一些實(shí)驗(yàn)與結(jié)果(高錳酸鉀、硫酸等不同濃度，光照或黑暗培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn))，本研究采用1.5%高錳酸鉀(光照)、500 mg/L赤霉素、500 mg/L青霉素、1 mol/L硫酸溶液和流水浸種處理麻花秦艽種子，達(dá)到了打破種子休眠的目的，縮短發(fā)芽時間和提高發(fā)芽效果。高錳酸鉀是一種強(qiáng)氧化劑，解除了麻花秦艽種子的種皮障礙，并為種子萌發(fā)提供氧元素和微量元素錳(Mn)，極大地加強(qiáng)了種子破皮后的呼吸和營養(yǎng)作用;光照下能夠誘導(dǎo)種子內(nèi)部細(xì)胞分裂素(cytokinin，CTK)含量的增加，從而使CTK能夠拮抗種子內(nèi)源抑制物如脫落酸的作用。高錳酸鉀可以清除麻花秦艽種子的內(nèi)源抑制物，因此，在播種或育苗前可用1.5%高錳酸鉀處理10 min自然光下破皮萌發(fā)。

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