梔子中兩種活性成分的含量測定

王曉娟 孫兆林 季宇彬 李志雄

(1哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心，哈爾濱，150076;2中國科學院上海藥物研究所，上海)

梔子始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為茜草科植物梔子(Gardenia jasminoides Ellis)的干燥成熟果實，味苦、性寒，具有瀉火除煩、清熱利尿、涼血解毒等功效，主治熱病心煩、黃疸尿赤、淋證澀痛、血熱吐衄，也可外治扭挫傷痛［1］。梔子中主要成分為環(huán)烯醚萜類，梔子苷、京尼平苷龍膽二糖苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯等是梔子中的主要生物活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明他們具有抗炎、利膽、鎮(zhèn)靜、抗老年癡呆等作用［2－3］。目前，有研究發(fā)現(xiàn)梔子還有抗流感病毒活性，吸收入血的有效成分含有梔子苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、山梔苷甲酯［4］等。對梔子進行含量測定的文獻報道多是單獨測定梔子苷，我們建立同時測定去乙酰車葉草苷酸甲酯和梔子苷含量的方法，為梔子資源的充分利用提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100色譜系統(tǒng)和英譜色譜工作站，KS5200H超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)，梔子苷對照品(中國藥品生物制品檢定所提供)，批號:110749－200714，去乙酰車葉草苷酸甲酯，實驗室自制，對照品純度均＞98%，分析天平(梅特勒－托利多XS105DU)。

乙腈(色譜純)，水(二次蒸餾水)，其他試劑均為分析純，梔子藥材購自上海康橋中藥飲片有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈 －0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫:0 min→6 min→20 min→28 min→32 min，乙腈5%→10%→15%→40%→5%，檢測波長:238 nm，流速:1.0 mL/min，柱溫:25℃，進樣量:20 μL。

2.2 對照品溶液的制備 分別取梔子苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇制成濃度分別為0.846 mg/mL、0.186 mg/mL的對照品溶液，將兩個對照品溶液稀釋適當倍數(shù)后制成混合對照品溶液。

2.3 樣品溶液的制備 稱取梔子粉末0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液過濾，即得。

2.4 系統(tǒng)適應性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液各20 μL，依法測定，記錄色譜圖，結(jié)果如圖1所示。去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷保留時間分別為 10.0 min、22.5 min，理論塔板數(shù)分別為19354、36296，與相鄰峰的分離度均大于1.5。

圖1 梔子HPLC色譜圖

2.5 線性范圍的考察 分別精密吸取2.2項下的對照品溶液0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL 置 10 mL 容量瓶中用50%甲醇稀釋至刻度，分別精密吸取20 μL注入高效液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得標準曲線方程:去乙酰車葉草苷酸甲酯:A=18364C+30964，r=0.9994，線性范圍為 0.009 ～0.186 mg/mL，梔子苷:A=23495C+238661，r=0.9996，線性范圍為0.042 ～0.846 mg/mL。

圖2 去乙酰車葉草苷酸甲酯標準曲線

圖3 梔子苷標準曲線

2.6 精密度試驗 精密吸取2.2項下混合對照品溶液20 μL，分別連續(xù)進樣6次，測得去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷峰面積的RSD分別為0.78%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取本品供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12 h 進樣測定，測得去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷峰面積的RSD分別為0.63%，0.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗 取同一批梔子粉末，平行制備6份供試品溶液，分別進樣測定，計算去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷的平均含量，其 RSD值分別為0.98%、1.16%，表明本方法的重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密稱定已知含量梔子藥材粉末6份，每份約0.25 g，按供試品溶液制備方法，分別制成供試液。分別精密稱定去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷適量制成濃度為0.132 mg/mL、0.338 mg/mL的對照品溶液，將去乙酰車葉草苷酸甲酯對照品稀釋10倍，分別取對照品溶液1 mL，供試液1 mL混合均勻，依法測定兩種成分的含量，結(jié)果表明去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷的平均回收率(n=6)分別為97.07%(RSD=1.48%)，100.51%(RSD=1.29%)。

2.10 樣品測定 分別精密吸取供試品溶液和對照品溶液各10 μL，按上述條件測定其峰面積并按外標法計算兩種成分的含量，結(jié)果見表1。

表1 梔子中兩種成分測定結(jié)果

3 討論

很多文獻［5－6］報道多是單獨測定梔子藥材中梔子苷的含量，作為梔子質(zhì)量控制的標準，但隨著研究的深入，不斷有新的藥理活性被發(fā)現(xiàn)，而活性成分不僅只有梔子苷，吸收入血的有效成分還有去乙酰車葉草苷酸甲酯、山梔苷甲酯等，因為這些成分含量較低，含量測定存在一定的困難，我們建立了同時測定梔子中去乙酰車葉草苷酸甲酯、梔子苷含量的方法，為梔子資源的充分利用提供科學依據(jù)。

提取方法的選擇，針對不同的提取方法(超聲、回流提取)，不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水)，不同提取時間(15 min、20 min、30 min、45 min、60 min)進行考察，最終選擇50%甲醇超聲提取30min可提取完全，與長時間提取結(jié)果相差較小。

流動相的選擇，實驗中用的流動相有乙腈－水，乙腈－0.1%磷酸水溶液，甲醇－水，甲醇－0.1%磷酸水溶液等，《中華人民共和國藥典》2010年版一部梔子含量測定采用乙腈－水(15∶85)［7］作為流動相，經(jīng)考察最終采用乙腈－0.1%磷酸水溶液梯度洗脫可使兩種成分與相鄰峰分離度均大于1.5，峰形較好。

［1］南京中醫(yī)藥大學.中藥大辭典［M］.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，2006:2240－2243.

［2］Junsheng Tian，Yuanlu Cui，Limin Hu，et al.Antidepressant－ like effect of genipin in mice［J］.Neurosci.Lett，2010，479:236 －239.

［3］Yang Yu，Zuolei Xie，Weiwei Ma，et al.Bioactive Iridoid Glucosides from the Fruit of Gardenia jasminoides［J］.Nat.Prod，2009，72:1459–1464.

［4］Quanjun Yang，Bin Wu，Yujing Shi，et al.Bioactivity － guided Fractionation and Analysis of Compounds with Anti－influenza Virus Activity from Gardenia jasminoides Ellis［J］.Arch Pharm Res，2012，35:9 －17.

［5］黃青萍.高效液相法測定不同產(chǎn)地梔子中梔子甙的含量報道［J］.醫(yī)學信息，2008，21(9):1706－1707.

［6］段起，莊義修，陳華師.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地梔子中梔子苷含量［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2009，5(6):20－21.

［7］中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)［S］.北京:化學工業(yè)出版社，2010:173.