針刺對缺血性腦血管病模型大鼠腦組織代謝型谷氨酸受體的影響

劉 悅 楊海濤 鄺偉川 黃 凡 陸彥青

(廣東省第二中醫(yī)院針灸康復(fù)科，廣州，510095)

流行病學(xué)資料顯示，腦血管病已成為我國城鄉(xiāng)居民死亡的第二大原因，位居惡性腫瘤之后，超過心臟病死亡人數(shù)。全國每年新發(fā)腦卒中約200萬人，每年死于腦血管病約150萬人，其中缺血性腦血管病(ICVD)占59.8%［1］。盡管對缺血性中風(fēng)的臨床診治、科研均取得了長足的發(fā)展，但其發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高的特點仍未能根本改變，缺血性中風(fēng)的防治至今仍是當(dāng)今世界醫(yī)學(xué)和社會密切關(guān)注的課題。

隨著研究的深入，缺血性腦血管病的發(fā)病機制不斷得到揭示，目前主要有以下觀點:氧自由基損傷學(xué)說［2］、鈣離子超載學(xué)說、一氧化氮(NO)和一氧化氮合成酶的作用［3］、炎癥細胞因子損害學(xué)說［4］、凋亡調(diào)控基因的激活理論［5］、缺血半暗帶功能障礙學(xué)說［6－8］、興奮性氨基酸(EAA)毒性作用等。

針對興奮性氨基酸，國內(nèi)外部分學(xué)者相繼提出代謝型谷氨酸在缺血性中風(fēng)發(fā)展中的重要作用，并測定了代謝型谷氨酸受體(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)族中的mGluR1受體，以后又相繼發(fā)現(xiàn)了其他7種家族成員，分別命名為mGluR2－8。mGluRs主要通過突觸前作用影響谷氨酸的釋放，通過該作用也有可能降低或阻止谷氨酸的神經(jīng)毒性作用。但代謝型谷氨酸受體在ICVD過程中的變化及其作用尚未得到充分重視。

本研究通過缺血性腦血管病動物模型［9］觀察mGluRs及其亞組在疾病過程中的變化，并進一步觀察針刺對其影響，論證針灸治療ICVD的有效性和科學(xué)性，探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 試劑及儀器 雄性3個月齡SD大鼠90只，體重160～180g(均由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，熒光定量PCR檢測試劑盒及相關(guān)反應(yīng)液等制劑(均由上?？迫A生物工程有限公司提供)。SuperScriptTM Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitorgen公司)，引物(上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成)，AbsoluteTM QPCR SYBR GreenMix實時熒光定量PCR試劑盒(AB-gene公司)，Biophotometer分光光度儀，Mastercycller PCR儀，ABI PRISM7300實時熒光定量PCR儀。

1.2 動物分組及處理 根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為對照組(Ⅰ組)，模型組(Ⅱ組)，模型+針刺組(Ⅲ組)，每組30只。將實驗動物飼養(yǎng)于室溫(22±2)℃正常光照的實驗室中，適應(yīng)2d后進行造模，采用頸內(nèi)動脈插入線栓法建立大腦中動脈栓塞(MCAO)模型，大鼠清醒后參照Kuluz神經(jīng)缺陷評分標準進行神經(jīng)功能缺陷評分，其評分達3分者視為造模成功。

對照組正常喂養(yǎng)，不施加任何干預(yù);模型組僅實施造模;模型+針刺組:針刺穴位定位參考《實驗針灸學(xué)》(中國中醫(yī)藥出版社，2003年第1版)中的穴位標記方法，選用“醒腦開竅”法，穴取:水溝、內(nèi)關(guān)(雙側(cè))、三陰交(雙側(cè))，頻率2Hz，電流3 mA，每次15min，針刺時間選擇在處死前30min。

1.3 樣本檢測 造模成功后分別于1h、3h、24h快速斷頭處死，每時段每組隨機選取10只大鼠，大鼠給予3%戊巴比妥鈉0.5mL腹腔注射麻醉后斷頭取腦，快速分開兩側(cè)大腦半球，在額極和枕極各去除后，得到缺血區(qū)和對應(yīng)的非缺血區(qū)，置于4℃4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定24h，常規(guī)脫水，浸蠟，包埋。

按照試劑盒操作方法提取腦組織mRNA隨后按說明書操作。采用熒光定量PCR方法檢測。利用Ct值計算正常大鼠腦組織中mGluRs受體各亞單位mRNA的相對表達量。Ct值是指擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)數(shù)，Ct值越大，參加反應(yīng)的起始模板量就越小，反之越大。

1.4 統(tǒng)計方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料以均數(shù)±標準差(s)表示，多組間數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析(One—Way ANOVA)。當(dāng)方差分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，進一步用(Studen—Newman—Keuls)q檢驗作兩兩比較。采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件完成分析過程。

2 實驗結(jié)果

由表1可以看出，對照組mGluRs在不同時段內(nèi)表達水平基本一致(P＞0.05);模型組則不同程度出現(xiàn)表達水平增加，隨著時間的增加，表達水平呈上升趨勢，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。模型+針刺組同樣出現(xiàn)表達水平的增加，1h、3h的水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，24h時 mGluR1、mGluR3、mGluR8的表達水平較模型組同時段降低，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示經(jīng)針刺干預(yù)后mGluR1、mGluR3、mGluR8的表達受到抑制。

表1 各組大鼠腦組織中mGluRs的表達(n=10，s)

表1 各組大鼠腦組織中mGluRs的表達(n=10，s)

注1:與對照組比較，*P＜0.05;與對照組及本組1h比較，△P＜0.05;與對照組比較，＊＊P＜0.01;與本組1h、3h比較，＊＊P＜0.05;與本組3h比較，▲P＜0.05。注2:mGluR4、mGluR6、mGluR7 未能完成檢測。

對照組1h 3h 24h mGluR1 0.954±0.158 1.051±0.304 0.986±0.198 1.525±0.580* 2.010±0.402△ 4.003±0.597＊＊ 1.645±0.682* 2.113±0.305△ 3.554±0.368 1h 3h 24h 模型組1h 3h 24h 模型+針刺組▲mGluR2 1.348±0.262 1.413±0.156 1.405±0.314 2.162±0.485* 3.550±0.601△ 4.672±0.421＊＊ 2.001±0.567* 3.603±0.511△ 4.783±0.436＊＊mGluR3 2.659±0.687 2.701±0.548 2.680±0.458 3.472±0.806* 4.052±0.731△ 5.325±0.823＊＊ 3.563±0.704* 4.137±0.608△ 4.603±0.320▲mGluR5 2.894±0.601 2.750±0.497 2.803±0.568 3.540±0.761* 4.337±0.910△ 6.022±0.752＊＊ 3.700±0.249* 4.099±0.638△ 5.900±0.305＊＊mGluR8 1.247±0.319 1.352±0.264 1.208±0.402 1.952±0.500* 3.107±0.396△ 4.587±0.645＊＊ 1.803±0.335* 3.099±0.530△ 3.923±0.602▲

3 討論

腦組織缺血缺氧是ICVD的根本機制。腦組織缺血缺氧將會引起神經(jīng)細胞腫脹、變性、壞死、凋亡、膠質(zhì)細胞腫脹、增生等一系列繼發(fā)反應(yīng)，包括興奮性氨基酸(EAA)毒性作用等。

谷氨酸介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)大多數(shù)突觸的快速興奮性傳遞，參與幾乎所有的腦功能調(diào)節(jié)過程，但是谷氨酸的過量釋放，可以導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)損傷和神經(jīng)變性，即谷氨酸神經(jīng)毒性作用，最終導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡［10－12］。mGluR是谷氨酸受體的一個主要類型，它是G蛋白偶聯(lián)的受體，其種類繁多，分布廣泛，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞過程中，參與多種生理、病理過程［13－14］。

阻止這種神經(jīng)毒性作用，可以從兩方面入手，即直接抑制谷氨酸的過量釋放或阻斷過量的谷氨酸引起的突觸后效應(yīng)。通過離子型受體阻斷劑直接阻斷谷氨酸突觸后效應(yīng)，因同時阻斷了正常的興奮性傳遞而無法體現(xiàn)其臨床價值［15］，而mGluRs通過突觸前機制抑制谷氨酸的釋放，則有可能降低或阻止谷氨酸的這種神經(jīng)毒性作用。

代謝型谷氨酸受體在ICVD過程中的變化及其作用尚未得到充分重視，本研究通過缺血性腦血管病動物模型［9］觀察mGluRs及其亞組在疾病過程中的變化，并進一步觀察針刺對其影響，論證針灸治療ICVD的有效性和科學(xué)性，探討其可能的作用機制。

本研究結(jié)果顯示，在腦組織缺血形成后mGluRs的表達水平明顯增加，而且隨著時間的推移，呈進一步升高的趨勢，提示腦組織的損害在不斷加重，模型+針刺組mGluR1、mGluR3、mGluR8的表達水平在腦組織損傷24h時較模型組同時段降低，提示經(jīng)針刺干預(yù)后mGluR1、mGluR3、mGluR8的表達受到抑制，可緩解損傷的進一步加重，從而保護腦組織，并進入恢復(fù)期。

本研究存在不足之處，在設(shè)計上未對24h后的表達進一步追蹤，缺乏系統(tǒng)資料。在檢測方面，由于試劑的限制未能完成全部指標的檢測。

有部分學(xué)者的研究亦表明，mGluRs在腦缺血、缺氧的病理損傷中發(fā)揮重要保護性作用［16］。如參與腦缺血耐受，但具體哪個亞型參與，有待闡明。腦缺血耐受涉及不同水平的多種因素，如星形膠質(zhì)細胞等因素，mGluRs對這些因素是否有影響，如何影響，這些都需進一步研究闡明。

綜上所述，本研究對mGluRs在腦組織缺血中表達水平進行了初步探討，因在實驗設(shè)計、檢測等方面的限制，與國內(nèi)外學(xué)者的相關(guān)研究既有相符又有相悖之處，尚需進一步完善。但應(yīng)當(dāng)說明的是，mGluRs在腦組織缺血損傷中的重要作用不容忽視，值得進一步研究。

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