應(yīng)用小鼠早期胚胎活性因子誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞再程序化為多能干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

劉 婷，王立斌，朱永朝，金毅然，李玉奎，魏 軍 (寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院寧夏人類干細(xì)胞研究所，寧夏 銀川 750004)

體細(xì)胞再程序化的研究主要包括核移植技術(shù)、細(xì)胞融合技術(shù)、利用卵細(xì)胞和干細(xì)胞的活性因子誘導(dǎo)體細(xì)胞的再程序化、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)這四種技術(shù)［1］，但是現(xiàn)行幾類再程序化技術(shù)均存在誘導(dǎo)效率低、遺傳變異高或者依賴病毒轉(zhuǎn)染，無法大批量應(yīng)用。鑒于此，本研究希望能夠建立一種新的應(yīng)用小鼠早期胚胎活性因子的再程序化技術(shù)生成多能干細(xì)胞?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料:6～8周齡ICR小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器及試劑:倒置顯微鏡、解剖顯微鏡(Olympus公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司)，PCR儀(Eppendorf公司)，胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶、Trizol(Invitrogen公司)，M2培養(yǎng)液、M16培養(yǎng)液(Sigma)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas公司)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠成纖維細(xì)胞的獲得與培養(yǎng):取孕13 d的母鼠，在無菌條件下取出胎鼠，分離背部皮膚，將組織充分剪碎，加入0.125%的胰蛋白酶在4℃消化1 h后，用等量的含F(xiàn)BS的DMEM終止消化，吸取上清液離心。去上清，加培養(yǎng)液，吹打懸浮后以5×105/ml密度接種于培養(yǎng)瓶，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 小鼠體外受精:體外受精及早期胚胎的培養(yǎng)均采用微滴培養(yǎng)法，將受精卵培養(yǎng)至3.5 d囊胚，大量收集凍于-80℃冰箱。

1.3.3 小鼠早期胚胎蛋白的獲得:將收集得到的小鼠3.5 d囊胚轉(zhuǎn)移至含有蛋白酶抑制劑的裂解液中超聲，12 000 rpm，4℃，離心15 min，取上清，測定蛋白濃度，凍于-80℃冰箱備用。

1.3.4 應(yīng)用小鼠早期胚胎蛋白誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞再程序化:將培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/ml，做10～15個(gè)20 μl微滴，將之前制備的小鼠3.5 d囊胚蛋白10 μl加入到微滴內(nèi)，隔天等量補(bǔ)充，待細(xì)胞增殖至90%密度后，常規(guī)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增。

1.3.5 誘導(dǎo)后多能干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:取誘導(dǎo)前后，不同階段的細(xì)胞于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化，采用MTT法測定P3代細(xì)胞生長曲線。

1.3.6 誘導(dǎo)后多能干細(xì)胞特異性基因表達(dá)鑒定:采用Trizol法抽提再程序化后小鼠多能干細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄，PCR測定多能干細(xì)胞特異性基因Oct 3/4(引物序列)，詳見表1。

表1 引物序列

1.3.7 誘導(dǎo)后多能干細(xì)胞多向分化潛能鑒定:按本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的誘導(dǎo)分化體系［5］，將獲得的小鼠多能干細(xì)胞誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化，并鑒定。

2 結(jié)果

2.1 小鼠成纖維細(xì)胞與3.5 d囊胚的形態(tài)學(xué)特征:原代培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞大約4～6 h貼壁，雜細(xì)胞較多，傳代至第三代，細(xì)胞形態(tài)均一，為梭形或多邊形，生長速度較快(見圖1)。體外受精獲得的胚胎各階段發(fā)育良好(見圖2)。

圖2 體外受精不同階段小鼠受精卵形態(tài)

2.2 再程序化后的小鼠多能干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察與生長特性鑒定:加入小鼠3.5 d囊胚蛋白后，可以觀察到小鼠成纖維細(xì)胞的胞質(zhì)開始部分回縮成圓形，細(xì)胞核增大，細(xì)胞增殖加快(見圖3)。MTT法測定第三代細(xì)胞的生長曲線，細(xì)胞傳代后潛伏期約為24 h，然后細(xì)胞增殖速度加快，進(jìn)入對數(shù)增殖期，72 h后生長速度減緩(見圖4)。

圖3 誘導(dǎo)再程序化后的小鼠多能干細(xì)胞形態(tài)

圖4 MTT法測定P3代細(xì)胞生長曲線

2.3 再程序化后的小鼠多能干細(xì)胞的基因表達(dá)鑒定:電泳結(jié)果顯示，再程序化后的多能干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞特異性基因Oct3/4，并且這種特性不受細(xì)胞代次影響(見圖5)。

圖5 Oct 3/4基因表達(dá)鑒定

2.4 再程序化后的小鼠多能干細(xì)胞的多向分化潛能鑒定:在脂肪細(xì)胞定向分化條件下，細(xì)胞停止增殖，胞質(zhì)增大，出現(xiàn)大量脂滴被油紅O染色為紅色(見圖6A)。在成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化條件下，細(xì)胞大片聚集重疊生長，茜素紅染色可見紅色鈣結(jié)節(jié)(見圖6B)。

圖6 再程序化后的小鼠多能干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)鑒定

3 討論

目前體細(xì)胞再程序化技術(shù)均存在各種局限。核移植技術(shù)雖然已成功應(yīng)用于多種動(dòng)物的克隆和人的早期胚胎的培育，但是成功率低并能誘發(fā)較高的遺傳變異。細(xì)胞融合技術(shù)雖然已成功應(yīng)用于細(xì)胞再程序化機(jī)制的研究，但其生成正常細(xì)胞的效率過低而不能應(yīng)用于臨床干細(xì)胞的培育?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)已經(jīng)先后成功培育出小鼠和人的多能干細(xì)胞［2-3］。并且，由此技術(shù)生成的多能干細(xì)胞已經(jīng)成功用于地中海貧血癥的模型動(dòng)物的治療。基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)是目前體細(xì)胞再程序化研究領(lǐng)域最成功的技術(shù)。然而，由于這一技術(shù)依賴于利用病毒的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，由此技術(shù)生成的多能干細(xì)胞因帶有病毒這一潛在的不安全因素而不能應(yīng)用于臨床。最后是利用卵細(xì)胞和干細(xì)胞的活性因子誘導(dǎo)體細(xì)胞的再程序化，已經(jīng)證明非洲爪蟾卵細(xì)胞和小鼠胚胎干細(xì)胞的蛋白內(nèi)容物能夠使體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成多能干細(xì)胞，但是這一技術(shù)尚未能培育出穩(wěn)定的再程序化干細(xì)胞。

為了解決現(xiàn)有再程序化技術(shù)應(yīng)用的局限，本研究提取小鼠早期胚胎總蛋白用于誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞再程序化，初步確定得到的細(xì)胞能夠長期增殖不分化，表達(dá)干細(xì)胞特異性基因Oct3/4，可以誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞和成骨細(xì)胞。證明在早期胚胎中含有可使體細(xì)胞轉(zhuǎn)化成多能干細(xì)胞的再程序化因子，可以不使用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法生成穩(wěn)定的多能干細(xì)胞。本研究如果能夠進(jìn)一步在人體細(xì)胞中得到證實(shí)，將有望獲得無病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，可用于臨床的患者個(gè)體化和疾病特異性的多能干細(xì)胞。

［1］ Takahashi K，and Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors［J］.Cell，2006，126(4):663.

［2］ Libin Wang，Yinxue Yang，Yongzhao Zhu，et al.Characterization of placenta-derived mesenchymal stem cells cultured in autologous human cord blood serum［J］.Molecular Medicine Reports，2012，6(4):760.

［3］ Takahashi K，Tanabe K，Ohnuki M，et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors［J］.Cell，2007，131(5):861.