維生素E對高脂血癥小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白基因表達(dá)的影響

霍 陽，初巍巍，宋 濤，陳 悅，趙躍萍，賈大林

體內(nèi)大量研究均證實，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能是發(fā)生動脈粥樣硬化的早期事件，并可促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成、斑塊侵蝕和急性冠脈綜合征的發(fā)展［1］。細(xì)胞凋亡是生物體的一種與細(xì)胞壞死截然不同的自殺程序，是維持細(xì)胞群體數(shù)量相對恒定的主動耗能過程。Bax蛋白基因需要與其家族中Bcl-2蛋白基因相互協(xié)調(diào)才能發(fā)揮抑制凋亡的效應(yīng)，形成凋亡調(diào)控系統(tǒng)。當(dāng)Bax同源二聚體形成時，便可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，隨著Bcl-2蛋白表達(dá)量上升，Bax二聚體逐漸分開，與Bcl-2蛋白形成更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2異源二聚體，從而中和Bax蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用［2］。這種二聚體調(diào)控細(xì)胞對凋亡的易感性，決定細(xì)胞的存亡，兩蛋白的比例是決定細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素［3］。

維生素E作為人體一種重要的脂溶性抗氧化劑，可改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，減少脂質(zhì)氧化，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞［4］。張思明等［5］研究表明維生素E水平與血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)及血壓水平呈負(fù)相關(guān)。而維生素E是否能通過降低血清TG與TC濃度來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡值得我們?nèi)ミM(jìn)一步探索，為今后臨床預(yù)防高脂血癥的并發(fā)癥提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:50只ICR雄性性成熟小鼠由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，6～8周齡，體重為28～32 g，合格證號:SCXK-(京)2007-0001。

1.1.2 主要試劑:維生素E為Sigma公司產(chǎn)品;TG、TC檢測所采用的7020全自動生物化學(xué)分析儀為日本日立公司產(chǎn)品，TG、TC檢測試劑盒為上海復(fù)星長征有限公司產(chǎn)品，RT-PCR試劑盒為日本TaKa-Ra公司產(chǎn)品，Bcl-2、Bax、GAPDH引物為日本TaKa-Ra公司產(chǎn)品，Trizol試劑為Introgen公司產(chǎn)品。

1.1.3 實驗飼料:高脂飼料由3%膽固醇、10%豬油、0.3%甲硫氧嘧啶、0.4%膽酸鈉組成，其與普通飼料均購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司［合格證號:京動(2000)第015號］。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物的分組與處理:將50只小鼠隨機(jī)分為A、B、C、D、E 5組，每組10只，人工控溫20～26℃，12 h光照，12 h黑暗，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲水取食。高脂血癥小鼠模型參考［1］。A組:高脂飼料喂養(yǎng);B組:維生素E 10 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);C組:維生素E 20 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);D組:維生素E 40 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);E組:普通飼料喂養(yǎng)。維生素E均用橄欖油配成混懸液，配好后避光4℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。連續(xù)灌胃4周，最后一次灌胃后禁食10 h，用頸椎脫臼法將小鼠處死并放于冰臺上，在無菌條件下抽取靜脈血并剪開胸腹腔，迅速分離腹主動脈。

1.2.2 RT-PCR法測定Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá):稱取30 mg腹主動脈并按Trizol試劑盒說明書提取出總RNA。鑒定RNA純度與完整性后按試劑盒說明以(oligo)dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以2 μl的cDNA為模板按試劑盒說明進(jìn)行PCR擴(kuò)增，GAPDH為內(nèi)參照。

反應(yīng)條件:94℃、1 min，Tm(根據(jù)不同的退火溫度定)50 s;72℃、1 min，Tm(根據(jù)不同的退火溫度定)30 s，進(jìn)行40個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物20 g/L瓊脂糖凝膠電泳40 min，紫外燈260 nm下進(jìn)行檢測。用Quantity one軟件分析各目的基因的條帶密度，以管家基因GAPDH為內(nèi)參照計算各個樣本的基因條帶密度的相對值。各引物由聚丙烯酰胺凝膠電泳(PCGE)純化，具體基因序列如下:

1.2.3 TG、TC的檢測:抽取的靜脈血用高速離心機(jī)(3000 r/min)離心5 min后，用吸管將上層血清吸出，隨后放入容積為1.5 ml的離心管中，并立即放于－30℃冰箱中冷凍保存，檢測時按試劑盒說明分別檢測TG、TC，所取標(biāo)本均在1周內(nèi)測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析，相關(guān)性分析使用Spearman相關(guān)分析，α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Bax基因mRNA水平的表達(dá)量 A組主動脈內(nèi)膜Bax基因mRNA水平的表達(dá)量高于B、C、D、E組(P＜0.05)，B、C、D組隨著維生素E劑量的增加mRNA水平的表達(dá)量逐漸減少，且3組間活性均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，B、C、D組mRNA水平的表達(dá)量均高于E組(P＜0.05)，結(jié)果見圖1、表1。

2.2 Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)量 A組主動脈內(nèi)膜Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)量低于B、C、D、E組(P＜0.05)，B、C、D組隨著維生素E劑量的增加表達(dá)量逐漸升高，且3組間活性均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，B、C、D組表達(dá)量均低于 E組(P＜0.05)，結(jié)果見圖1、表1。

2.3 Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)量比值A(chǔ)組主動脈內(nèi)膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)量比值高于B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組隨著維生素E劑量的增加mRNA水平的表達(dá)量比值逐漸減少，且3組間活性均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，B、C、D組主動脈內(nèi)膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)量比值均高于 E組(P＜0.05)，結(jié)果見圖1、表1。

圖1 5組小鼠主動脈內(nèi)膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)量

表1 5組小鼠主動脈內(nèi)膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)比較(±s)

表1 5組小鼠主動脈內(nèi)膜Bax、Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)比較(±s)

注:A組:高脂飼料喂養(yǎng);B組:維生素E 10 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);C組:維生素E 20 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);D組:維生素E 40 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);E組:普通飼料喂養(yǎng)。與 E組比較，aP＜0.05;與 A組比較，cP＜0.05;與B組比較，eP＜0.05;與C組比較，gP＜0.05

組別 鼠數(shù) 積分光密度值Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 10 0.531 ±0.034 0.731 ±0.024 0.643 ±0.076 A 組 10 1.078 ±0.053a 0.375 ±0.032a 2.713 ±0.052a B 組 10 0.931 ±0.042ac 0.463 ±0.012ac 2.232 ±0.064ac C 組 10 0.929 ±0.053ace 0.542 ±0.007ace 1.741 ±0.054ace D 組 10 0.632 ±0.131aceg0.613 ±0.031aceg0.843 ±0.041 E組aceg

2.4 Bax與Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)量關(guān)系Bax基因與Bcl-2基因mRNA水平的表達(dá)量之間為負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= －0.635，P=0.036)。

2.5 血清TG濃度 A組血清中TG的濃度明顯高于 B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組血清中 TG 的濃度隨著維生素E劑量的增加逐漸降低，但B、C、D組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，B、C、D組血清中TG的濃度均高于E組(P＜0.05)，結(jié)果見表2。

2.6 血清TC濃度 A組血清中TC的濃度明顯高于 B、C、D、E 組(P ＜0.05)，B、C、D 組血清中 TC 的濃度隨著維生素E劑量的增加逐漸降低，但B、C、D組間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，B、C組血清中TG的濃度均高于E組(P＜0.05)，D組與E組間血清TG濃度無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，結(jié)果見表2。

表2 5組小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇濃度比較(±s，mmol/L)

表2 5組小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇濃度比較(±s，mmol/L)

注:A組:高脂飼料喂養(yǎng);B組:維生素E 10 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);C組:維生素E 20 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);D組:維生素E 40 mg/(kg·d)+高脂飼料喂養(yǎng);E組:普通飼料喂養(yǎng)。與 E組比較，aP＜0.05;與 A組比較，cP＜0.05;與B組比較，eP＜0.05;與C組比較，gP＜0.05

組別 鼠數(shù) 甘油三酯 總膽固醇E組10 0.984 ±0.231 1.833 ±0.231 A 組 10 1.873 ±0.382a 3.153 ±0.873a B 組 10 1.743 ±0.231ac 2.127 ±0.732ac C 組 10 1.437 ±0.342ace 1.987 ±0.432ace D 組 10 1.288 ±0.126aceg 1.873 ±0.321aceg

3 討論

高脂血癥是影響動脈粥樣硬化的主要因素［6-9］，可在早期損傷內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)活性氧產(chǎn)生，增加細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡或壞死［10-12］。本實驗通過高脂飲食喂養(yǎng)4周成功誘導(dǎo)高脂血癥小鼠模型，主動脈Bax蛋白mRNA水平的表達(dá)量與Bax/Bcl-2明顯增高，而Bcl-2蛋白mRNA水平的表達(dá)量明顯降低，與E組比較高脂血癥組凋亡相關(guān)基因表達(dá)量明顯升高，表達(dá)高脂血癥可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，與李蓉［1］等所得的實驗結(jié)果相同。近年來大量研究表明高脂血癥導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡主要是由于氧化應(yīng)激反應(yīng)所致，長期大劑量脂肪的攝入，體內(nèi)會產(chǎn)生大量反應(yīng)性氧類［13］。而維生素E可以有效的捕捉、清除超氧陰離子自由基、單線態(tài)氧和過氧化氫等，保護(hù)生物膜免受氧化損傷和過氧化損傷，增加機(jī)體對自由基的清除能力，是已被確認(rèn)的自由基清除劑［14］。本實驗結(jié)果顯示，給予維生素E后Bax蛋白mRNA水平的表達(dá)量與Bax/Bcl-2均降低，而Bcl-2蛋白mRNA水平的表達(dá)量升高，血清TC與TG濃度均降低。

Bax基因發(fā)揮抑制凋亡的效應(yīng)需要與其家族中Bcl-2基因相互協(xié)調(diào)，從而形成一個凋亡調(diào)控系統(tǒng)。當(dāng)Bax同源二聚體形成，調(diào)控細(xì)胞對凋亡的易感性，決定細(xì)胞的存亡。Bax占優(yōu)勢時細(xì)胞死亡，Bcl-2則阻止細(xì)胞死亡。Bax不僅與Bcl-2形成二聚體，還可以自身形成二聚體誘導(dǎo)凋亡，兩蛋白的比例是決定細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素［15］。Bcl-2可在細(xì)胞周期的任一階段抑制細(xì)胞凋亡［16-19］，抗凋亡的主要機(jī)制是:①作為抗氧化劑，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，阻斷氧化作用對細(xì)胞成分的破壞;②影響細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，改變鈣離子分布，鈣離子激活內(nèi)源性內(nèi)切酶和谷氨肽轉(zhuǎn)移酶;③抑制有促凋亡作用的細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿;④保護(hù)細(xì)胞，抑制DNA斷裂［20-23］。本實驗通過給予外源性維生素E后Bcl-2基因表達(dá)量增加，說明維生素E與Bcl-2基因有協(xié)同效應(yīng)，共同對抗高脂血癥導(dǎo)致的氧化損傷。但是Bcl-2基因表達(dá)是通過何種途徑使血清TC、TG濃度降低還需我們在今后的科研與臨床工作中進(jìn)一步探索。

本實驗進(jìn)一步證實了高脂血癥可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡基因表達(dá)，而口服一定量的維生素E能降低其血清TG與TC的濃度，并降低凋亡基因的表達(dá)、升高抑制凋亡基因的表達(dá)，其具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究，而維生素E這種安全可靠的保健藥物的使用為今后臨床工作中預(yù)防與治療高脂血癥導(dǎo)致的冠狀動脈粥樣硬化有著重要的指導(dǎo)意義。

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