張 倩,李居怡,趙嘉慶,王亞娜,朱明星,趙 巍
細(xì)粒棘球蚴病(Echinococcosis)又稱包蟲病,是細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲(即棘球蚴)感染寄生所致的一種人畜共患性寄生蟲?。?-5]。該病嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)生產(chǎn),在我國主要流行于新疆、甘肅、青海、寧夏、內(nèi)蒙古、西藏、陜西和四川西部等畜牧業(yè)地區(qū)[6-9],目前已經(jīng)證實(shí)我國有25個(gè)省區(qū)存在感染病例[10]。據(jù)調(diào)查顯示,2004—2008年全國包蟲病報(bào)告病例累計(jì)10 790例,涉及27個(gè)省,病例報(bào)告的范圍呈擴(kuò)大趨勢,其中寧夏回族自治區(qū)共報(bào)告962例[11-13]。由于缺乏對棘球蚴的生長、發(fā)育以及其在人體內(nèi)生長環(huán)境的深入研究和認(rèn)識,目前包蟲病的防治效果并不理想,有關(guān)包蟲囊液營養(yǎng)代謝成分的研究報(bào)道多集中在家畜,如牛、羊等[14-15],而關(guān)于人體肝包蟲囊液中蛋白成分研究鮮見報(bào)道。本研究擬運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對細(xì)粒棘球蚴囊液的蛋白質(zhì)成分進(jìn)行初步研究,分析棘球蚴生長環(huán)境的蛋白質(zhì)及構(gòu)成情況,為深入了解細(xì)粒棘球絳蟲幼蟲的生長環(huán)境和所需營養(yǎng)物質(zhì)、蛋白代謝途徑以及發(fā)育過程奠定基礎(chǔ),亦為尋找有效控制手段提供新的研究思路。
1.1 標(biāo)本來源 取寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科為包蟲病患者實(shí)施手術(shù)后摘除的包囊。
1.2 儀器與試劑 MALDI-TOF質(zhì)譜儀(Waters)、Bio-Rad電泳儀、Bio-Rad電泳槽、Bio-Rad凝膠掃描儀、Bio-Rad切膠儀、Power Dry LL3000凍干機(jī)(Thermo)、SmartSPECTM核酸蛋白微量分析儀(Bio-Rad)、高速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI)、超聲波細(xì)胞破碎儀(昆山市超聲儀器有限公司)、-85℃超低溫冰箱(美國NuAire公司)、超純水儀(密理博貿(mào)易有限公司)、AE100電子天平(梅特勒-托利多)、320pH酸度計(jì)(梅特勒-托利多)、LQP-B-4顆粒制冰機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器公司)、ES-135高壓滅菌鍋(日本TOMY公司)、可移動加樣器(天根生化科技(北京)有限公司)、超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)。
三氯醋酸 (TCA)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、胰蛋白酶(色譜純)、二硫蘇糖醇 (DTT)、CHAPS、PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)、碳酸氫銨、CHCA、TFA(三氟乙酸),以上均購置于Sigma公司;礦物油(Mineral Oil)、Bio-Lyte 3/10、Ampholyte-40%等購于Bio-Rad公司;乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA·2H2O)、考馬斯亮藍(lán)G250、抑肽素 A、亮肽素(leupeptin)、SDS、溴酚藍(lán)(Bromophenol Blue)、Tris-base、Tris-HCl、尿素、甘氨酸、丙烯酰胺(Acrylamide)、甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate)、TEMED、乙腈(ACN)、B-巰基乙醇等購置 BBI公司,冰乙酸、甘油、NaOH、HCl、丙酮(acetone)、甲醇、異丙醇、95%酒精、磷酸等均為國產(chǎn)。
1.3 方法
1.3.1 提取囊液:無菌條件下分離包蟲單個(gè)小泡囊,抽取混合囊液,離心后沉淀為原頭蚴、上清為原始囊液,于-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>
1.3.2 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)提取:從-80℃冰箱取出冷凍保存的原始囊液樣本,經(jīng)室溫融化,不經(jīng)任何處理。取5 ml囊液于凍干機(jī)中凍干成粉末,加入適量上樣緩沖液,置沸水中加熱5 min,混勻后即為SDS-PAGE樣品。分別利用直接裂解法、TCA-丙酮沉淀法[16]、Ready PrepTM2-D Cleanup Kit(除鹽)、AurumTMSerum Protein Mini Kit(除高峰度蛋白),蛋白濃度測定均采用Bradford法[17]處理提取物。
1.3.3 雙向電泳:蛋白樣品在經(jīng)過第一向等電聚焦電泳(7 cm、17 cm 的膠條,pH 3~10、pH 7~10)和第二向SDS-PAGE后,放入考馬斯亮藍(lán)溶液染色。
1.3.4 圖像采集和分析:根據(jù)等電點(diǎn)和分子量不同在凝膠上將蛋白分離。采用GS-800 Calibrated Densitometer投射掃描,用 PDQuest 8.0 2D Analysis Software進(jìn)行分析。
1.3.5 肽指紋圖譜(PMF)的獲取:取樣品酶解液0.5 μl與基質(zhì) 0.5 μl(CHCA 5 mg/ml加 45%乙腈,45%甲醇加0.1%TFA)混勻,點(diǎn)在上樣板上。設(shè)置MALDI-TOF-MS程序,在反射模式,電壓2000 V,肽質(zhì)量片段m/z在800~3000 Da范圍內(nèi)進(jìn)行分析,獲得PMF。
1.3.6 蛋白質(zhì)PMF檢索及蛋白質(zhì)鑒定:應(yīng)用最新公布的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫SWISSPROT進(jìn)行檢索,查詢結(jié)果以分?jǐn)?shù)顯示。分?jǐn)?shù)大于閾值時(shí)即表示檢索結(jié)果可信(P<0.05),否則檢索結(jié)果不可信。
2.1 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)果SDS-PAGE電泳顯示蛋白質(zhì)主要分布在43.0~97.4 kD與14.4 kD,這2處蛋白高度表達(dá),各類蛋白表達(dá)水平差異較大。這給后期的雙向電泳的分離帶來很大困難,會導(dǎo)致水平條紋的產(chǎn)生(見圖1)。
2.2 細(xì)粒棘球蚴囊液二維電泳圖譜的處理 囊液二維電泳圖譜經(jīng) PDQuest 8.0 2D Analysis Software分析后,大概能捕捉到30個(gè)蛋白斑點(diǎn)(見圖2),大部分蛋白分布在43.0 ~97.4 kD,而14.4 kD 處蛋白丟失較多,蛋白的等電點(diǎn)分布在PI 5~9之間。
圖1 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白的SDS-PAGE電泳
圖2 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)二維電泳圖譜
2.3 細(xì)粒棘球蚴囊液中各種蛋白質(zhì)的PMF的獲取全自動凝膠切膠儀將圖2上PDQuest 8.0 2D A-nalysis Software捕捉到的蛋白斑點(diǎn)切下,膠內(nèi)酶解后MALDI-TOF-MS得到PMF,酶解后30種蛋白,通過質(zhì)譜獲取了21種蛋白,列舉蛋白PMF見圖3、4。
圖3 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)No.3蛋白肽指紋圖譜
圖4 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)No.12肽指紋圖譜
2.4 細(xì)粒棘球蚴囊液中各種蛋白質(zhì)PMF的生物信息學(xué)分析 通過MASCOT軟件將各蛋白的PMF文件上傳到SWISSPROT數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)No.3、12、16、18檢索分?jǐn)?shù) >閾值70分,結(jié)果可信(P<0.05)(圖 5、6),而 No.1檢索分?jǐn)?shù)為 27分(P >0.05),其他蛋白PMF檢索結(jié)果評分較低,結(jié)果不可靠。從表1的鑒定結(jié)果來看,No.3為人 β-血紅蛋白;No.12、18為人白蛋白;No.16為人血清鐵傳遞蛋白。因細(xì)粒棘球絳蟲基因組序列目前還未知,相關(guān)的蛋白數(shù)據(jù)庫目前還不完善,所以囊液里面的其他蛋白斑點(diǎn)未能得到有效的鑒定。
圖5 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)No.3匹配結(jié)果
圖6 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)No.16匹配結(jié)果
表1 細(xì)粒棘球蚴囊液蛋白質(zhì)肽指紋圖譜MASCOT檢索鑒定結(jié)果
蛋白質(zhì)組學(xué)主要是通過雙向電泳技術(shù)分離生物樣品中的蛋白質(zhì),進(jìn)而通過質(zhì)譜獲取每種蛋白的PMF,最終利用生物信息學(xué)分析工具將每種蛋白的PMF與已有的蛋白數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索比對,根據(jù)MASCOT評分結(jié)果對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行預(yù)測[18]。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是全面、有效、快速、可信的研究手段,利用它分析囊液的蛋白構(gòu)成是準(zhǔn)確的,并且可以結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)做很好的對比分析。通過各種條件的比較發(fā)現(xiàn)采用17 cm、PH 7~10的膠條,上樣量為200 μg,TCA-丙酮沉淀法,能夠使囊液中的蛋白在二維電泳圖譜上得到更有效的分離,蛋白斑點(diǎn)較多、更清晰,但缺陷是有些偏酸性蛋白可能就丟失了;而除高豐度蛋白的方法不利于囊液二維電泳圖譜的建立。趙慰先等發(fā)現(xiàn)人體棘球蚴囊液中幾乎為白蛋白和球蛋白,而其他蛋白含量非常少,其中44%為白蛋白,α-球蛋白及β-球蛋白占39%,而17%為γ-球蛋白,且囊液中的蛋白質(zhì)具有抗原性[19]。本實(shí)驗(yàn)將細(xì)粒棘球蚴囊液中的蛋白根據(jù)不同的分子量及等電點(diǎn)采用雙向電泳進(jìn)行有效分離,發(fā)現(xiàn)囊液中約有30種蛋白,集中在43.0~97.4 kD與14.4 kD,PI在5~9之間。揭示囊液中主要是以白蛋白和球蛋白為主,其他蛋白種類和含量均很少。
經(jīng)過MALDI-TOF-MS對囊液凝膠上每個(gè)酶解后的蛋白進(jìn)行處理,獲取了21種蛋白的PMF,而其余9個(gè)斑點(diǎn)未能成功獲取,其原因可能是:①PDQuest 8.0 2D Analysis Software 分辨率較高,對于非常微量的蛋白,經(jīng)切膠酶解后打質(zhì)譜,因未達(dá)到質(zhì)譜要求濃度級別而未獲取;②比較微量的蛋白在酶解時(shí)因其含量的損失達(dá)不到質(zhì)譜要求濃度未獲取。
目前有關(guān)蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)庫較多,其中SWISSPROT數(shù)據(jù)庫是規(guī)模最大、數(shù)據(jù)最全的,根據(jù)酶解方法選擇相應(yīng)的搜索選項(xiàng),將獲取的蛋白PMF與數(shù)據(jù)庫中已知的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,根據(jù)評分結(jié)果的高低,可對未知蛋白做大致的定性分析。Coltorti等[20]研究發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴囊液中的白蛋白、球蛋白來自于宿主組織,它是通過擴(kuò)散的方式進(jìn)入包蟲囊中,并不是通過主動吸收過程,因?yàn)檠逯械牡鞍资悄乙褐械?000~10000倍。本研究根據(jù)MASCOT評分結(jié)果初步鑒定出囊液中含有血清鐵傳遞蛋白、白蛋白、β-血紅蛋白3種,其他蛋白因評分很低,結(jié)果不可信。通過生物信息學(xué)手段分析血清鐵傳遞蛋白、白蛋白、β-血紅蛋白均來自于人體本身。推測3種蛋白在棘球蚴生長發(fā)育過程中可能發(fā)揮以下作用:①人血清鐵傳遞蛋白可能是為運(yùn)輸原頭蚴生長所需要的鐵而發(fā)揮作用;②人體白蛋白可能為原頭蚴生活提供必要的能源物質(zhì);③人血紅蛋白可能是為細(xì)粒棘球蚴原頭蚴運(yùn)輸氧氣和二氧化碳,以維持囊液的酸堿平衡。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)初步建立了細(xì)粒棘球蚴囊液雙向電泳圖譜,為后期研究細(xì)粒棘球蚴囊液的蛋白質(zhì)組成提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和比對圖譜,而囊液里面的其他蛋白未得到有效鑒定,還需進(jìn)一步深入研究。
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