負壓創(chuàng)面治療對燒傷創(chuàng)面膿毒癥小鼠死亡率的影響

劉 洋，胡大海，董茂龍，白曉智，李小強

負壓創(chuàng)面治療(negative pressure wound therapy，NPWT)已在臨床使用了20多年，大量文獻表明，NPWT治療針對創(chuàng)面愈合，尤其是對于復雜的難愈性創(chuàng)面能顯著控制創(chuàng)面感染［1］、縮短創(chuàng)面愈合時間［2］。Kubiak 等［3］研究表明 NPWT 可以明顯減輕腹腔膿毒癥的全身炎性反應，保護臟器功能。Steven等［4］的研究表明，NPWT能降低開放性骨折創(chuàng)面中銅綠假單胞菌的含量，然而其作用機制還未徹底闡明。NPWT對深二度燒傷創(chuàng)面的早期應用，能顯著降低燒傷淤滯帶的范圍，促進創(chuàng)面愈合［5-6］。本研究建立了銅綠假單胞菌感染的小鼠燙傷創(chuàng)面模型，觀察NPWT治療對由創(chuàng)面感染導致膿毒癥小鼠病死率的影響，為進一步探索其相關(guān)作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級成年雄性C57小鼠108只，體質(zhì)量18～20 g，8～12周齡，清潔環(huán)境飼養(yǎng)，由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供。

1.2 主要儀器與試劑 RNPT 1型負壓治療儀及一次性負壓治療海綿購自山西以諾醫(yī)療科技有限公司，Xenogen IVIS 200小動物活體成像系統(tǒng)購自美國，由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，DU@800分光光度儀由美國Beckman Coulter公司生產(chǎn)。細菌熒光素酶目的基因luxCDABE標記的野生型銅綠假單胞菌菌株P(guān)AO1-1ux由西北大學生命科學院段康民教授惠贈，使用前將菌株擴增培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以比濁法調(diào)整菌液濃度約達(1.0×109)cfu/ml。

1.3 動物模型建立

1.3.1 燙傷動物模型建立:用3%戊巴比妥鈉按40 mg/kg劑量腹腔注射行全身麻醉，背部脫毛。脫毛、用清水洗滌后擦干背部皮膚，在小鼠背部脫毛區(qū)正中部位，放置燙傷模具，開啟蒸汽燙傷儀電源，將蒸汽噴頭伸入圓筒，保持在距離皮膚1 cm位置，形成一個直徑2 cm的Ⅲ度圓形燙傷創(chuàng)面，造成的燙傷深度采用病理切片證實。

1.3.2 燙傷后感染模型建立:燙傷實驗當天，用體積分數(shù)3%異氟烷吸入麻醉，麻醉成功后，1 ml注射器抽取(1.0 ×109)cfu/ml銅綠假單胞菌菌液 50 μl，緩慢注射于燙傷皮下，將動物放回籠中，自然復蘇，單籠飼養(yǎng)，自由飲食。24 h后無菌條件下，剪去燙傷痂皮，用3%過氧化氫、甲硝唑、生理鹽水蘸洗創(chuàng)面2次。

1.4 動物分組及實驗方法

1.4.1 NPWT對照實驗:健康雄性 C57小鼠60只按隨機數(shù)字表法分為對照組和實驗組，每組30只。

按照1.3.1 和 1.3.2 項建立模型后，分別進行以下處理:實驗組按創(chuàng)面形狀剪裁醫(yī)用海綿，將剪有3個側(cè)孔的塑料引流管的一端插入海綿，另一端用貼膜將海綿固定在創(chuàng)面上，然后接引流瓶和負壓泵，調(diào)節(jié)負壓為－125 mmHg，持續(xù)負壓吸引。對照組無菌生理鹽水濕敷(WTD)，單層凡士林紗布覆蓋創(chuàng)面后包扎固定。實驗當天計為0 d。于0、1、3、5、7 d 5個時間點處死小鼠，每組每個時間點處死6只小鼠留取標本。

1.4.2 生存分析實驗:其余48只小鼠按隨機數(shù)字表法分為燙傷組、燙傷感染組、燙傷感染NPWT處理組和燙傷感染換藥組，每組12只。

均按1.3.1建立燙傷模型，燙傷感染組、燙傷感染NPWT處理組和燙傷感染換藥組按1.3.2建立感染模型。燙傷感染NPWT處理組給予創(chuàng)口持續(xù)負壓吸引，燙傷感染換藥組給予WTD治療。

1.5 觀察指標

1.5.1 創(chuàng)面細菌熒光強度檢測:在實驗0、1、3、5、7 d，用小動物活體成像系統(tǒng)檢測標記菌熒光強度，發(fā)光強度單位是光子/(秒·厘米2·單位角度)。通過檢測創(chuàng)面熒光標記菌的相對表達量，比較實驗組和對照組熒光強度差異，以此來反映銅綠假單胞菌在小鼠創(chuàng)面的侵襲情況。

1.5.2 肺臟、肝臟、腎臟組織化學染色觀察:在實驗第3天收集實驗組和對照組動物器官樣本，進行石蠟包埋、固定。取創(chuàng)面上緣皮膚組織、左肺下葉、肝右葉、整個右側(cè)腎臟為器官標本，10%福爾馬林充分固定，依次進行沖洗、常溫下不同濃度乙醇溶液脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色。光鏡下觀察，保存圖像并進行統(tǒng)計分析。

1.5.3 7 d生存分析:連續(xù)觀察7 d，記錄4組小鼠死亡時間，實驗結(jié)束后進行生存分析。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)整理、分析，計量資料結(jié)果以均數(shù) ±標準差(±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用兩樣本 t檢驗。生存分析實驗使用Kaplan-Meier法分析。α=0.05為檢驗水準。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面細菌熒光強度 實驗開始時，小鼠創(chuàng)面標記菌的熒光表達量兩組沒有明顯差異。1 d時對照組熒光表達量明顯升高，1、3、5 d時均顯著高于實驗組(P＜0.01)。其中在實驗第3天熒光表達量達到最大值。治療第7天，兩組細菌熒光光子計數(shù)相似。見圖1、表1。

圖1 兩組燙傷感染小鼠創(chuàng)面細菌熒光強度比較與對照組比較，bP＜0.01

2.2 肺、肝、腎組織化學染色比較 在光學顯微鏡下觀察各組組織切片，肺組織切片，對照組可見肺泡壁折疊、塌陷，炎性反應明顯，有大量炎性細胞浸潤，而實驗組中肺組織炎性浸潤明顯較輕，僅少量炎性細胞浸潤;肝組織切片中，實驗組較對照組組織水腫輕，炎性細胞浸潤少;腎組織切片中，實驗組較對照組炎性細胞浸潤少，組織水腫輕，腎小管壞死數(shù)量少。見圖2。

表1 兩組燙傷感染小鼠創(chuàng)面細菌熒光強度比較［±s，×108光子/(秒·厘米2·單位角度)］

表1 兩組燙傷感染小鼠創(chuàng)面細菌熒光強度比較［±s，×108光子/(秒·厘米2·單位角度)］

注:實驗組應用負壓創(chuàng)面治療，對照組應用無菌生理鹽水濕敷。與對照組相同治療天數(shù)比較，bP＜0.01

組別 鼠數(shù)0 d 1 d 3 d 5 d 7 d對照組 30 7.9±2.8 44.0±11.0 47.0±17.0 15.0±29.0 4.8 2.9±2.3±1.8實驗組 30 11.0±6.8 2.9±2.5b 6.6±1.9b 3.9±5.6b

2.3 生存率統(tǒng)計分析 7 d內(nèi)燙傷組全部存活，燙傷感染NPWT組生存率顯著高于燙傷感染組(P＜0.05)，燙傷感染NPWT組與燙傷感染換藥組生存率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。前3 d燙傷感染NPWT組死亡率顯著低于燙傷感染換藥組(25%VS 41.7%，P ＜0.05)，見表2 和圖3。

圖2 兩組燙傷感染3 d小鼠器官組織病理圖(HE)

表2 4組燙傷小鼠7 d內(nèi)死亡數(shù)及生存率(例)

圖3 4組燙傷小鼠7 d內(nèi)生存曲線圖

3 討論

許多資料顯示NPWT作用機制可能與抑制細菌在創(chuàng)面組織中擴散密切相關(guān)［7］。Morykwas［8］發(fā)現(xiàn)NPWT能夠有效地清除豬背部創(chuàng)面的細菌。隨后，Moues［9］通過觀察證明NPWT相比常規(guī)濕敷換藥能有效減少創(chuàng)面革蘭陰性菌數(shù)量。這些證據(jù)說明NPWT能夠抑制某些細菌在創(chuàng)面增殖，但這些實驗主要通過分泌物培養(yǎng)法來測定細菌種類，定量細菌，無法觀察致病菌侵襲的范圍和擴散程度，對整個創(chuàng)面細菌分布情況難以完整系統(tǒng)的了解。因此，不能充分反映NPWT對創(chuàng)面及深部組織細菌的抑制作用，也無法反映治療效果。此外，NPWT清除燒傷創(chuàng)面的銅綠假單胞菌感染的作用也有待進一步研究。

為了解決上述問題，本研究建立了細菌熒光素酶標記的銅綠假單胞菌感染的小鼠燒傷創(chuàng)面模型，分別使用NPWT或WTD治療，觀察標記菌在創(chuàng)面擴散的情況并量化標記菌數(shù)。結(jié)果表明，NPWT治療在早期(治療72 h)即能顯著降低標記菌的熒光光子計數(shù)，然而在實驗結(jié)束時(治療第7天)，兩組細菌熒光光子計數(shù)相似。這一結(jié)果表明，NPWT在感染早期治療效果明顯優(yōu)于WTD，同時WTD不能抑制銅綠假單胞菌在創(chuàng)面的增殖和侵襲，雖然在實驗結(jié)束時兩組細菌熒光光子計數(shù)相似，但結(jié)合治療后生存率比較，使用WTD的小鼠生存率仍低于應用NPWT小鼠。此外，實驗結(jié)果還提示在第1次使用NPWT后細菌熒光表達量即明顯降低，然而對照組在第一次治療后的3 d仍顯著持續(xù)增加。以上結(jié)果表明，在燒傷感染早期使用NPWT能夠有效減少創(chuàng)面組織細菌含量，這為臨床使用NPWT提供了一定的借鑒價值。

7 d生存分析顯示，應用NPWT和WTD治療后，模型小鼠的死亡率分別下降到50.0%和66.7%。雖然生存率NPWT和換藥組之間沒有顯著差異，但在小鼠死亡最快的前3 d中，死亡率統(tǒng)計NPWT組較對照組明顯降低(25%VS 41.7%，P＜0.05)，結(jié)果提示NPWT治療能減少銅綠假單胞菌感染創(chuàng)面導致的燒傷創(chuàng)面膿毒癥的死亡率。

組織病理學檢查顯示NPWT組中內(nèi)臟器官的炎癥反應及細胞損傷低于對照組。表明NPWT在減輕體內(nèi)的炎癥反應和保護內(nèi)臟器官方面起到了積極的作用。

綜上所述，在感染創(chuàng)面早期使用NPWT能夠快速降低創(chuàng)面細菌含量，緩解全身炎性失控性反應，減輕臟器損傷，降低燒傷創(chuàng)面膿毒癥的發(fā)病率和死亡率，本研究為臨床NPWT的使用提供了實驗基礎。在未來研究中，我們還將以此為基礎，繼續(xù)探索NPWT在治療燒傷創(chuàng)面感染中的生物學效應及機制，為進一步合理高效的使用該技術(shù)提供理論支持和實驗證據(jù)。

［1］Sheppard F R，Keiser P，Craft D W，et al.The majority of US combat casualty soft-tissue wounds are not infected or colonized upon arrival or during treatment at a continental US military medical facility［J］.The American Journal of Surgery，2010，200:489-495.

［2］Fang R，Dorlac W C，F(xiàn)laherty S F，et al.Feasibility of negative pressure wound therapy during intercontinental aeromedical evacuation of combat casualties［J］.Trauma，2010，69(1):S140-145.

［3］Kubiak B D，Albert S P，Gatto L A，et al.Peritoneal negative pressure therapy prevents multiple organ injury in a chronic porcine sepsis and ischemia/reperfusion model［J］.Shock，2010，34(5):525-534.

［4］Steven J，Daniel S，Scott M，et al.Negative pressure wound therapy reduces pseudomonas wound contamination more than staphylococcus aureus［J］.Orthop Trauma，2010，24(9):598-602.

［5］Morykwas M J，David L R，Schneider A M.Use of subatmospheric pressure to prevent progression of partialthickness burns in a swine-model［J］.Burn Care Rehabil，1999，20(2):15-21.

［6］Banwell P E.The effect of topical subatmosphericpressure(TSAP)on experimental partial thickness burns［C］.Las Vegas:American Burns Association Meeting，2000.

［7］肖偉平.改良V-Y臀大肌筋膜皮瓣在骶部褥瘡治療中的應用［J］.首都醫(yī)科大學學報，2012，33(4):552-553.

［8］Morykwas M J，Argenta L C，Shelton-Brown E I，et al.Vacuum-assisted closure:A new method for wound controland treatment:Animal studies and basic foundation［J］.AnnPlastSurg，1997，38(2):553-562.

［9］Moues C M，van Toorenenbergen A W，Heule F，et al.The role oftopical negative pressure in wound repair:expression of biochemicalmarkers in wound fluid during wound healing［J］.Wound Repair Regen，2008，16(4):488-494.