丙戊酸鈉對(duì)燒傷休克大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化和通透性的影響

周?chē)?guó)勇，胡 森，賈赤宇

嚴(yán)重?zé)齻缙谕霈F(xiàn)大量體液和血漿滲出到體外及第三間隙，其引起的低血容量性休克是嚴(yán)重?zé)齻笃鞴俟δ軗p傷及預(yù)后不良的病理生理基礎(chǔ)。在一些特殊情況下，如現(xiàn)代戰(zhàn)場(chǎng)或自然災(zāi)害現(xiàn)場(chǎng)，常規(guī)休克補(bǔ)液治療往往難以及時(shí)實(shí)施［1］。因此，休克的藥物治療逐漸發(fā)展為目前研究的熱點(diǎn)［2-5］。

丙戊酸鈉(VPA)是一種組蛋白去乙?；敢种苿?HDACI)，以往作為抗癲癇藥物。國(guó)內(nèi)外最新研究表明，VPA具有良好的生命維持作用，其表現(xiàn)為可延長(zhǎng)動(dòng)物失血性休克時(shí)的存活時(shí)間，但作用機(jī)制尚不明確［6］。另有研究顯示，HDACI可以抑制炎癥細(xì)胞活化、聚集，減少炎癥介質(zhì)釋放，減輕炎癥反應(yīng)［7］。因此我們假設(shè)VPA能抑制燒傷休克大鼠肺組織炎癥反應(yīng)，保護(hù)微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，降低其肺血管通透性，從而改善重度燒傷休克的預(yù)后。為了驗(yàn)證此假設(shè)，我們進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料 VPA、2-甲基-2-戊烯酸(2M2P，Sigma公司，美國(guó));Rabbit Anti-VEGF、Anti-ICAM-1和Anti-E-selectin(Invitrogen，美國(guó));TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(Roche，美國(guó))。

1.2 50%TBSAⅢ度燙傷休克大鼠模型制備 雄性清潔級(jí)SD大鼠，體重220～250 g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。氯胺酮+速眠新(2∶1，0.5 ml/kg)肌注麻醉后，大鼠背、腹部及雙下肢備皮，給予水浴(背部及雙下肢均為15 s、腹部8 s);假燙組水溫為37℃;燙傷組水溫為80℃。觀察動(dòng)物一般狀況，頸動(dòng)脈置管監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓，燙傷深度病理檢查證實(shí)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案及分組 實(shí)驗(yàn)分為假燙組、燙傷組、燙傷+2M2P組與燙傷+VPA組。根據(jù)各組死亡率不同補(bǔ)足各時(shí)間點(diǎn)存活大鼠至6只(燙傷組除外)，總計(jì)使用大鼠150只。假燙組和燙傷組程序按上述模型制作過(guò)程進(jìn)行，2M2P組和VPA組在燙傷后即刻皮下注射100 mg/ml相應(yīng)藥物300 mg/kg，假燙組及燙傷組皮下注射3 ml/kg生理鹽水。

1.4 取材與指標(biāo)檢測(cè) 分別于燙傷后2 h，6 h和12 h處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。腹主動(dòng)脈取血，檢測(cè)紅細(xì)胞壓積(HCT)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和肌酐(Cr)。取新鮮肺組織，應(yīng)用干濕重法檢測(cè)肺組織含水率，伊文斯藍(lán)(Evans blue，EB)比色法檢測(cè)肺微血管通透性，HE染色觀察肺組織病理變化，免疫組織化學(xué)染色Power Vision兩步法檢測(cè)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelium cell，PMEC)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)、E-選擇素(E-selectin)和細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達(dá)，以CMIAS病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)病理圖像進(jìn)行定量分析，TUNEL法檢測(cè)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率，采用 Spot Advance Version 4.0.2采集圖像并分析計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 50%TBSAⅢ度燙傷休克大鼠模型的鑒定

2.1.1 一般狀況:燙傷后大鼠早期即出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)少、不進(jìn)食，死亡前有戰(zhàn)栗、抽搐等表現(xiàn)。背、腹部及雙下肢燙傷創(chuàng)面呈皮革狀，創(chuàng)面發(fā)白，部分出現(xiàn)潰瘍。

2.1.2 平均動(dòng)脈壓(MAP):致傷后2 h大鼠MAP即迅速下降至約50 mmHg;6 h左右，MAP再次快速下降，隨后多數(shù)大鼠死亡，12 h存活率為0。

2.1.3 臟器功能及死亡率:致傷后6 h，燙傷組大鼠的血漿CK-MB、ALT、Cr等肝腎臟器功能指標(biāo)較假燙組顯著升高(P＜0.05)，見(jiàn)表1;燙傷組大鼠6 h和12 h死亡率分別為80%(24/30)和100%(12/12)。

表1 2組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷6 h臟器功能變化(±s)

表1 2組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷6 h臟器功能變化(±s)

注:燙傷組水浴水溫為80℃，假燙組水浴水溫為37℃;aP ＜0.05

組別 鼠數(shù) 肌酸激酶同工酶(IU/L)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(U/L)肌酐(μmol/L)假燙組6 11.9 ±1.3 41.67 ±6.35 57.83 ±5.35燙傷組 6 26.8 ±3.6a 108.89 ±10.45a89.84 ±8.97a

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 HCT:燙傷組肺組織HCT較假燙組明顯增加(P＜0.05)，燙傷+VPA組及燙傷+2M2P組2 h和6 h HCT均明顯低于燙傷組(P＜0.05)，燙傷+VPA組較燙傷+2M2P組降低更明顯(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.2.2 肺組織含水率:傷后2 h和6 h，燙傷組肺組織含水率較假燙組明顯增加(P＜0.05)，而燙傷+2M2P組和燙傷+VPA組顯著低于燙傷組(P＜0.05)，但仍高于假燙組。治療組間相比，燙傷+VPA組各時(shí)間點(diǎn)均低于燙傷+2M2P組，但只有6 h差異顯著(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.2.3 肺血管通透性:傷后2 h和6 h，燙傷組EB含量明顯高于假燙組，而燙傷+2M2P組和燙傷+VPA組比燙傷組顯著降低(P＜0.05);治療組間相比，傷后6 h和12 h時(shí)間點(diǎn)燙傷+VPA組肺血管通透性顯著低于燙傷+2M2P組(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.2.4 PMEC凋亡率:燙傷組2 h和6 h PMEC凋亡率較假燙組顯著升高;與燙傷組相比，燙傷+VPA組和燙傷+2M2P組2 h和6 h凋亡指數(shù)均顯著降低;治療組間相比，燙傷+VPA組各時(shí)間點(diǎn)均顯著低于燙傷+2M2P組(P＜0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 肺組織病理學(xué)變化 HE染色后鏡下觀察可見(jiàn):假燙組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)肺水腫、間質(zhì)水腫及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。而燙傷組和燙傷+2M2P組大鼠傷后2 h肺組織可見(jiàn)部分肺泡壁增厚，毛細(xì)血管充血，少量肺泡腔內(nèi)出血。傷后6 h及12 h，上述變化加重，肺泡壁明顯增厚，毛細(xì)血管內(nèi)皮腫脹，少數(shù)肺泡中充滿嗜伊紅液體，肺泡腔內(nèi)多見(jiàn)出血，并伴有中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管黏膜水腫、上皮壞死脫落，部分區(qū)域可見(jiàn)肺大泡形成。燙傷+VPA組大鼠傷后2 h肺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，個(gè)別區(qū)域毛細(xì)血管輕度充血，未見(jiàn)明顯組織水腫及出血。傷后6～12 h可見(jiàn)肺泡壁輕度增厚，毛細(xì)血管充血較前明顯，血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹，少數(shù)肺泡腔可見(jiàn)出血，部分肺泡腔閉塞，支氣管黏膜輕度水腫，炎癥細(xì)胞輕度浸潤(rùn)，黏膜纖毛少量脫失。見(jiàn)圖1。

表2 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后觀察指標(biāo)的變化(±s)

表2 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后觀察指標(biāo)的變化(±s)

注:燙傷組水浴水溫為80℃，假燙組水浴水溫為37℃，燙傷+2M2P組燙傷后即刻皮下注射2-甲基-2-戊烯酸300 mg/kg，燙傷+VPA組燙傷后即刻皮下注射丙戊酸鈉300 mg/kg。與假燙組同時(shí)間比較，aP＜0.05;與燙傷組同時(shí)間比較，cP＜0.05;與燙傷+2M2P組同時(shí)間比較，eP＜0.05

組別 鼠數(shù) 紅細(xì)胞壓積(%)肺組織含水率(%)伊文斯藍(lán)濃度(μg/g)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率(%)假燙組2 h 6 35.42 ±1.13 65.58 ±2.39 41.39 ±3.78 4.31 ±0.54 6 h 6 34.24 ±1.52 66.23 ±3.12 42.04 ±4.38 4.50 ±0.38 12 h 6 35.62 ±1.61 64.84 ±2.35 40.81 ±3.89 4.76 ±0.62燙傷組2 h 6 43.74 ±1.23a 72.15 ±2.41a 68.43 ±4.37a 19.44 ±2.25a 6 h 6 49.57 ±1.12a 79.38 ±2.46a 74.29 ±7.46a 21.76 ±2.86a 12 h0－－－－燙傷+2M2P組2 h 6 40.32 ±1.14c 69.32 ±1.34c 51.73 ±3.24c 15.34 ±1.74c 6 h 6 45.72 ±1.37c 76.52 ±2.12c 67.52 ±4.79c 16.43 ±1.82c 12 h 6 43.26 ±1.73 72.39 ±2.57 64.92 ±3.57 18.46 ±2.02燙傷+VPA組2 h 6 38.26 ±1.46ce 68.26 ±2.26c 49.74 ±4.19c 12.03 ±1.33ce 6 h 6 42.53 ±1.26ce 73.16 ±1.86ce 58.40 ±3.19ce 13.72 ±1.95ce 12 h 6 40.24 ±1.21e 71.83 ±2.15 57.28 ±4.53e 15.13 ±1.62e

圖1 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后肺組織病理學(xué)變化(HE×200)

2.4 肺組織 VEGF、ICAM-1、E-selectin表達(dá)VEGF、E-selectin和ICAM-1主要于血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后表達(dá)，E-selectin和ICAM-1是炎癥反應(yīng)時(shí)中性粒細(xì)胞黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞并向血管外轉(zhuǎn)移的主要配體。傷后2～6 h，燙傷+VPA組肺組織中上述因子的陽(yáng)性率顯著低于燙傷組(P＜0.05)，燙傷 +2M2P組與燙傷組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。治療組間相比，傷后各時(shí)間點(diǎn)燙傷+VPA組均顯著低于燙傷+2M2P組(P＜0.05)，見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后肺組織相關(guān)因子表達(dá)陽(yáng)性率的比較(±s)

表3 4組大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后肺組織相關(guān)因子表達(dá)陽(yáng)性率的比較(±s)

注:燙傷組水浴水溫為80℃，假燙組水浴水溫為37℃，燙傷+2M2P組燙傷后即刻皮下注射2-甲基-2-戊烯酸300 mg/kg，燙傷+VPA組燙傷后即刻皮下注射丙戊酸鈉300 mg/kg。與假燙組同時(shí)間比較，aP＜0.05;與燙傷組同時(shí)間比較，cP＜0.05;與燙傷 +2M2P 組同時(shí)間比較，eP ＜0.05

組別 鼠數(shù) 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子E-選擇素 細(xì)胞間黏附分子-1假燙組2 h 6 0.032 ±0.011 0.057 ±0.012 0.048 ±0.022 6 h 6 0.031 ±0.008 0.047 ±0.011 0.050 ±0.017 12 h 6 0.035 ±0.012 0.052 ±0.009 0.049 ±0.013燙傷組2 h 6 0.360 ±0.017a0.320 ±0.013a0.450 ±0.023a 6 h 6 0.390 ±0.018a0.370 ±0.014a0.470 ±0.019a 12 h0－－－燙傷+2M2P組2 h 6 0.340 ±0.016 0.330 ±0.015 0.420 ±0.025 6 h 6 0.370 ±0.020 0.350 ±0.021 0.460 ±0.026 12 h 6 0.340 ±0.015 0.350 ±0.017 0.440 ±0.017燙傷+VPA組2 h 6 0.220 ±0.015ce0.240 ±0.013ce0.300 ±0.018ce 6 h 6 0.270 ±0.013ce0.280 ±0.016ce0.340 ±0.021ce 12 h 6 0.260 ±0.017e0.270 ±0.020e0.330 ±0.025e

3 討論

戰(zhàn)爭(zhēng)、大規(guī)模突發(fā)事故及自然災(zāi)害(如火災(zāi)、地震)時(shí)，往往短時(shí)間內(nèi)成批出現(xiàn)休克傷員;但由于交通破壞、醫(yī)療資源匱乏，使得常規(guī)靜脈補(bǔ)液等抗休克治療難以實(shí)施，從而大大增加病死率。因此，無(wú)靜脈液體復(fù)蘇條件下休克救治技術(shù)的研究對(duì)于戰(zhàn)場(chǎng)、事故及災(zāi)害等情況的現(xiàn)場(chǎng)早期救治具有重要意義。無(wú)靜脈液體復(fù)蘇條件時(shí)休克救治技術(shù)主要有口服液體復(fù)蘇、抗休克褲、生命維持和細(xì)胞保護(hù)藥物等。其中生命維持與細(xì)胞保護(hù)藥物作為一種簡(jiǎn)便可行的治療方案，具有廣闊的應(yīng)用前景，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

多項(xiàng)研究表明，HDACI在失血、創(chuàng)傷及膿毒癥等休克模型中具有抗休克和提高存活率的作用［8-11］。Gonzales等［12］研究發(fā)現(xiàn):60% 血容量失血大鼠傷前及傷后即刻皮下注射VPA，致傷后12 h VPA組大鼠存活率為70%，而生理鹽水對(duì)照組大鼠存活率則為0;VPA組大鼠生存時(shí)間是生理鹽水對(duì)照組大鼠的5倍。胡森等［13］發(fā)現(xiàn):在無(wú)靜脈復(fù)蘇條件下，VPA能有效地維持50%TBSAⅢ度燒傷休克犬的平均動(dòng)脈壓，保護(hù)臟器功能，并顯著提高動(dòng)物的24、48 h存活率;白慧穎等［14］研究則表明VPA可以改善燙傷休克大鼠心肌酶學(xué)指標(biāo)，減輕其組織損傷。本研究證實(shí)了VPA顯著改善燒傷休克主要靶器官之一的肺組織損傷，具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

在重度燒傷早期，由于血漿大量滲出到體外及第三間隙，血液濃縮，可表現(xiàn)為HCT上升;雖然此時(shí)紅細(xì)胞受多種因素影響出現(xiàn)大量破壞，但總體上容量的下降表現(xiàn)更明顯，因此HCT可間接反映燒傷休克時(shí)血容量降低程度。肺組織含水率是燒傷休克大鼠炎癥組織水腫程度的直接體現(xiàn)。EB比色法直接體現(xiàn)了肺微血管通透性的變化。大鼠50%TBSAⅢ度燙傷后2～12 h血HCT持續(xù)升高原因即在于血容量丟失，血細(xì)胞大量濃縮。肺組織含水率增加，出現(xiàn)肺水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，表明重度燒傷后由于炎癥介質(zhì)的大量釋放，損傷微血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺微血管通透性增加，血液從血管中轉(zhuǎn)移到血管外，引起有效循環(huán)血量的降低;炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化和轉(zhuǎn)移則直接損傷了肺泡組織的換氣功能。燙傷后即刻給予300 mg/kg VPA皮下注射，血HCT和肺組織含水率顯著低于燙傷組，肺水腫等病理改變也明顯減輕。

組蛋白乙?；腔蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［15］，VPA作為一種HDACI，其對(duì)組蛋白乙?；降恼{(diào)節(jié)可能是生物功能多樣化的主要原因［16］。Fu等［17］研究表明:VPA主要作用于HDACⅠ類(lèi)分子(HDAC1與HDAC3)，影響細(xì)胞生存與凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而發(fā)揮生命維持與細(xì)胞保護(hù)作用。2M2P分子結(jié)構(gòu)與VPA類(lèi)似，但對(duì)組蛋白乙?；囊种谱饔幂^弱。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)照藥物2M2P與VPA，結(jié)果也表明VPA的作用機(jī)制與其對(duì)組蛋白乙?；降恼{(diào)控相關(guān)。

在燒傷休克治療中，我們認(rèn)為VPA對(duì)臟器功能的保護(hù)作用可能與其對(duì)炎癥因子表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。研究表明，脂多糖(LPS)致小鼠膿毒癥模型給予單次口服 HDACI SAHA 可以降低 TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ水平，并呈劑量依賴性［18］。重度燒傷后也易出現(xiàn)上述炎癥因子的瀑布樣釋放，形成全身性炎癥反應(yīng)，是心、肝、肺等重要臟器損傷的病理生理基礎(chǔ)。在肺組織中，這些炎癥因子的具體作用表現(xiàn)為損傷PMEC，增加血管通透性，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化和血管外轉(zhuǎn)移。在本實(shí)驗(yàn)中，VPA對(duì)重度燒傷后血管活性因子表達(dá)率的調(diào)控及肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果也充分證實(shí)了上述推論。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了VPA在重度燒傷休克動(dòng)物模型中能抑制內(nèi)皮細(xì)胞活化，減輕其損傷，改善血管通透性，從而保護(hù)肺臟功能;其作用可能與其對(duì)組蛋白乙酰化調(diào)控相關(guān)，但具體途徑尚不清楚。進(jìn)一步研究可針對(duì)明確其具體基因和信號(hào)途徑調(diào)控機(jī)制入手，為HDACI在燒傷休克治療的臨床應(yīng)用提供更明確的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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