血腦屏障通透性在外傷性癲癇大鼠中的作用機(jī)制研究

劉明剛，朱 權(quán)，孫美珍，孫 洋，李 偉

外傷性癲癇（post－traumatic epilepsy）是指腦組織從腦外傷開(kāi)始，經(jīng)過(guò)一定的潛伏期，產(chǎn)生了慢性、復(fù)發(fā)性、自發(fā)性癲癇發(fā)作的過(guò)程，外傷性癲癇是最適合研究人類癲癇發(fā)生機(jī)制的模型[1]。癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)疾病之一，50%以上病人由各種腦損害引起，即癥狀性癲癇，而腦外傷后發(fā)生癲癇的危險(xiǎn)性比正常人高3倍以上，其發(fā)生率為4%～53%，占癥狀性癲癇的首位[2]。外傷性癲癇的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，最近的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明血－腦屏障（BBB）的破壞在外傷性癲癇的發(fā)病機(jī)制中起了關(guān)鍵作用[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)自由落體損傷模型分析外傷性大鼠血腦屏障破壞程度與癲癇發(fā)作的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雌雄性各半SD大鼠62只，體重200g～250g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物均在實(shí)驗(yàn)環(huán)境下飼養(yǎng)1周，給予適宜溫度（23℃～25℃）和24h光照／暗周期，允許自由飲食。將其隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組10只，不給損傷處理；甘露醇應(yīng)用組26只，給予頭部損傷處理，在頭部損傷后24h內(nèi)，用25%甘露醇注射液1.5g／kg尾靜脈注射，每天1次，連續(xù)3d，以提高血腦屏障的滲透性；模型對(duì)照組26只，給予頭部損傷處理，用等體積生理鹽水尾靜脈注射，在頭部損傷后24h內(nèi)應(yīng)用，每天應(yīng)用1次，連續(xù)用3d?？瞻讓?duì)照組再分為兩組分別飼養(yǎng)3d和3個(gè)月，每組5只；甘露醇應(yīng)用組和模型對(duì)照組再分別各分為3組，飼養(yǎng)3d和7d各8只，飼養(yǎng)3個(gè)月各10只。

1.2 動(dòng)物模型的制備 將SD大鼠用10%水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頂部去毛，消毒，沿正中線切開(kāi)頭皮暴露顱骨，長(zhǎng)度約1.5cm，在矢狀縫右側(cè)，據(jù)前囟0.15cm，矢狀縫0.25cm處為中心開(kāi)骨窗，直徑為0.4cm，但不損傷硬膜，然后將大鼠連到自由落體打擊裝置上，釋放重錘，根據(jù)吳旭等[4]研究制作成重型顱腦損傷模型。打擊后切口內(nèi)注入40 000U慶大霉素注射液0.5mL預(yù)防感染，縫合頭皮?？瞻讓?duì)照組僅開(kāi)顱窗不施加打擊。

1.3 方法

1.3.1 BBB通透性測(cè)定 飼養(yǎng)3d和7d的大鼠用于血腦屏障通透性的測(cè)定。伊文氏藍(lán)（EB）的滲出量與血腦屏障的開(kāi)放程度成正相關(guān)，應(yīng)用分光光度計(jì)在EB最大吸收光譜635nm處檢測(cè)腦組織中的EB含量，可以作為判斷血腦屏障開(kāi)放程度的一種定量指標(biāo)，其腦組織EB含量亦代表血清白蛋白的滲出量[5]7μg／mL、1μg／mL、2μg／mL、4μg／mL、6μg／mL、8 μg／mL、10μg／mL為EB標(biāo)準(zhǔn)濃度，繪制伊文氏藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 行為學(xué)觀察 飼養(yǎng)3個(gè)月的大鼠用于行為學(xué)觀察。采用人工觀察和視屏監(jiān)測(cè)大鼠24h活動(dòng)，按Racine’s分級(jí)（0級(jí)，無(wú)驚厥；1級(jí)，閉眼、胡須動(dòng)，口、鼻、面肌陣攣；2級(jí)，在1級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)節(jié)律性點(diǎn)頭；3級(jí)，在2級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)前肢陣攣；4級(jí)，在3級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)后肢站立；5級(jí)，在4級(jí)基礎(chǔ)上出現(xiàn)跌倒發(fā)作）記錄大鼠癲癇發(fā)作情況。

1.3.3 腦電圖采集 模型建立后觀察發(fā)現(xiàn)有類似癲癇發(fā)作2次以上的大鼠進(jìn)行腦電圖信息采集，將大鼠用20%烏拉坦注射液（5mL／kg）麻醉，固定于腦立體定位儀上，用電生理信號(hào)采集儀描記大鼠皮層腦電活動(dòng)，當(dāng)出現(xiàn)重復(fù)暴發(fā)性棘波、棘慢復(fù)合波或尖波等癲癇樣放電波幅超過(guò)基線的兩倍并持續(xù)5s以上時(shí)確定為EEG發(fā)作。

1.3.4 標(biāo)本制作 10%水合氯醛注射液3mL／kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于解剖板上，劍突下開(kāi)胸，從心尖部將穿刺針向主動(dòng)脈方向插入，剪開(kāi)右心耳，用300mL生理鹽水灌注沖洗，接著用4%的多聚甲醛200mL～300mL灌注，在整個(gè)灌注過(guò)程中可以觀察到大鼠全身肌肉顫動(dòng)，而后逐漸僵硬、強(qiáng)直，再將腦組織完整取出，浸泡于4%多聚甲醛中后固定，4℃冰箱保存，1周內(nèi)切片。每塊厚約2mm，經(jīng)多聚甲醛固定、石蠟包埋后作連續(xù)冠狀切片，片厚5μm，每隔2張取1張切片，每例標(biāo)本取切片不少于8張。

1.3.5 免疫組化染色（SABC法） 切片常規(guī)脫蠟至水，用0.3%H2O2室溫處理5min～10min以滅活內(nèi)源性酶，入0.01 mol／L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中微波抗原修復(fù)10min，再次PBS漂洗后入5%BSA封閉液，室溫20min，后按ABC法行抗GFAP免疫組織化學(xué)反應(yīng)。依次孵育于兔抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白（GFAP）抗體稀釋液（1∶200），37℃1h；生物素化山羊抗兔IgG（1∶150）37℃20min；SABC（1∶150）37℃20min。以上每一步驟之后均用0.01mol／L PBS（pH7.2～7.6）漂洗5min×3次。蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明和封片，顯微鏡觀察。以上試劑均購(gòu)于博士德生物試劑公司。

1.3.6 星形膠質(zhì)細(xì)胞計(jì)數(shù) GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)水平可代表星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的情況[6]7倍光鏡下對(duì)海馬結(jié)構(gòu)進(jìn)行GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，每只鼠各取三張切片，每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)不重復(fù)視野取平均值，同時(shí)觀察該區(qū)域GFAP免疫陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)。利用Image Pro Plus 5.0圖像分析軟件分析，取每張切片中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度（IOD）平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠死亡情況 空白對(duì)照組無(wú)死亡；甘露醇組死亡8只，存活18只；模型對(duì)照組死亡7只，存活19只?？偹劳雎蕿?8.8%（15／52）。

2.2 3組EB含量比較 模型建立后3d和7d，甘露醇應(yīng)用組、模型對(duì)照組與空白對(duì)照組損傷側(cè)皮層EB濃度比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），甘露醇應(yīng)用組和模型對(duì)照組EB比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。詳見(jiàn)表1。

表1 3組大鼠皮層EB濃度（±s） μg／g

表1 3組大鼠皮層EB濃度（±s） μg／g

組別 損傷側(cè)皮層對(duì)側(cè)皮層3d 7d 3d 7d空白對(duì)照組 5.83±1.19 5.83±1.19 5.79±1.26 5.79±1.26模型對(duì)照組 65.40±9.271） 16.64±1.921） 6.83±1.37 5.54±0.58甘露醇應(yīng)用組 83.73±8.321）2） 19.44±2.351）2） 12.23±0.89 6.75±2.31與空白對(duì)照組，1）P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.01

2.3 行為學(xué)及腦電圖觀察 空白對(duì)照組未觀察到癲癇發(fā)作；實(shí)驗(yàn)組早期24h至7d內(nèi)有10只大鼠可以觀察到閉眼、胡須動(dòng)、面肌痙攣和節(jié)律性點(diǎn)頭等癥狀。模型建立7d后，3個(gè)月內(nèi)模型對(duì)照組存活的7只大鼠中有2只出現(xiàn)面積痙攣、節(jié)律性點(diǎn)頭癥狀，持續(xù)時(shí)間10s～30s；甘露醇組存活的7只大鼠中有2只出現(xiàn)面積痙攣、節(jié)律性點(diǎn)頭癥狀，1只出現(xiàn)前肢陣攣，本實(shí)驗(yàn)未觀察到3級(jí)以上的發(fā)作。甘露醇組與模型對(duì)照組癲癇發(fā)作的大鼠數(shù)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。對(duì)照組大鼠腦電圖以9Hz～12Hz的α波或17Hz～19Hz的β波為主，波幅20 μV～80μV。慢性期癲癇大鼠EEG表現(xiàn)為背景節(jié)律增快，波幅為150μV～300μV，能觀察到明顯的棘波、尖波等。

2.4 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)觀察和計(jì)數(shù) 鏡下觀察可見(jiàn)皮層內(nèi)被染成棕褐色GFAP的免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞呈彌散分布，細(xì)胞胞體腫脹，界限清晰，數(shù)量增多，突起增粗，胞核被蘇木素復(fù)染為深藍(lán)色，較小，居于細(xì)胞中央或偏位。對(duì)照組大鼠GFAP陽(yáng)性細(xì)胞胞體較小，突起少而細(xì)。各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及IOD值見(jiàn)表2。甘露醇應(yīng)用組、模型對(duì)照組大鼠皮質(zhì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及IOD值與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），甘露醇組與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及IOD值（±s）

表2 各組大鼠皮質(zhì)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及IOD值（±s）

分組 n 平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 積分光密度（IOD）空白對(duì)照組 5 30.14±3.86 1289±368.45模型對(duì)照組 7 46.86±5.331） 2649±348.591）甘露醇應(yīng)用組 7 52.76±6.521）2） 3210±398.241）2）與空白對(duì)照組，1）P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.01

3 討 論

本研究我們通過(guò)自由落體致重型顱腦損傷模型研究血腦屏障破壞與癲癇發(fā)作之間的關(guān)系，給予1 200g＊cm的打擊力度造成重型顱腦損傷，損傷的程度越大動(dòng)物死亡率越高，中重度顱腦損傷死亡率高達(dá)30%～40%[7]，本實(shí)驗(yàn)大鼠的死亡率為28.8%（15／52），與文獻(xiàn)報(bào)道相近。實(shí)驗(yàn)組分別給予尾靜脈注射生理鹽水和甘露醇后發(fā)現(xiàn)，甘露醇能進(jìn)一步開(kāi)放血腦屏障（P＜0.01），但3個(gè)月期間觀察兩組大鼠的致癲癇率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），分析認(rèn)為一方面是由于樣本數(shù)量較少，另一方面是觀察周期的限制，研究認(rèn)為大鼠外傷后需經(jīng)過(guò)大約6周至11個(gè)月，平均7個(gè)月才會(huì)有約50%的大鼠產(chǎn)生自發(fā)性癲癇發(fā)作[8]。但兩組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說(shuō)明血腦屏障開(kāi)放程度越大，膠質(zhì)細(xì)胞增生越明顯。

外傷后往往出現(xiàn)血腦屏障的破壞[9]，近年來(lái)，血腦屏障的破壞被認(rèn)為在癲癇形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]7年Cornford等[11]首先通過(guò)觀察超微結(jié)構(gòu)研究了血腦屏障與癲癇的關(guān)系，隨后的試驗(yàn)也證實(shí)了血腦屏障破壞后經(jīng)過(guò)一定潛伏期能夠誘發(fā)癲癇發(fā)作[12]，van Vliet等[10]用甘露醇人為造成血腦屏障開(kāi)放，發(fā)現(xiàn)已患有慢性癲癇的大鼠其發(fā)作頻率較前明顯增加，這提示血腦屏障通透性的改變可能是癲癇發(fā)作的重要機(jī)制。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)血腦屏障破壞后白蛋白滲出在癲癇的發(fā)生中起了重要作用，本研究也證實(shí)血腦屏障開(kāi)放后能夠引起白蛋白滲出，而且開(kāi)放程度越大，白蛋白滲出量越多，白蛋白外溢導(dǎo)致腦組織直接暴露于血清白蛋白足以引起癲癇發(fā)生[13]，且白蛋白引發(fā)的癲癇活動(dòng)強(qiáng)度表現(xiàn)為劑量依賴式[14]。而白蛋白滲出后是如何引起癲癇發(fā)作的，Tomkins等[15]認(rèn)為無(wú)論是血腦屏障破壞還是將白蛋白直接暴露于腦組織，都會(huì)引起膠質(zhì)細(xì)胞激活，使其對(duì)鉀離子的緩沖減弱，細(xì)胞外K＋增高，導(dǎo)致神經(jīng)元過(guò)度興奮。Cacheaux等[16]研究發(fā)現(xiàn)血清白蛋白溢出到腦組織后通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體（TGF－βRs）被膠質(zhì)細(xì)胞攝取，引起鉀內(nèi)向整流通道（Kir4.1）表達(dá)減少，細(xì)胞外鉀離子積累增加，導(dǎo)致N－甲基－D－天門冬氨酸（NMDA）受體介導(dǎo)的神經(jīng)興奮性增高，最終引發(fā)癲癇樣活動(dòng)[17]。血腦屏障破壞后，損傷處的腦組織就開(kāi)始進(jìn)行一系列的病理變化：神經(jīng)元壞死和膠質(zhì)細(xì)胞增生[3]，而這些膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性改變稱為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，一般涉及星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的變化和數(shù)量增加[18]，本研究也證實(shí)血腦屏障破壞后，會(huì)出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化，而且血腦屏障開(kāi)放程度越大，膠質(zhì)細(xì)胞增生的數(shù)量越多。星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活是其增生的基礎(chǔ)，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生可能導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞外Na＋／K＋濃度平衡失調(diào)，使神經(jīng)細(xì)胞興奮的閾值降低，神經(jīng)活動(dòng)過(guò)度而發(fā)生癲癇[19]。Vessal等[20]給已經(jīng)發(fā)生癲癇的大鼠分別注射生理鹽水和L－AA（一種阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞增生的氨基酸）觀察發(fā)現(xiàn)，給予阻斷星形膠質(zhì)細(xì)胞增生后，大鼠癲癇發(fā)作程度明顯減輕，這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞的增生在癲癇反復(fù)發(fā)作中起著重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)在腦外傷后的1周左右可觀察到大鼠點(diǎn)頭、面肌痙攣等癲癇樣癥狀，推測(cè)與BBB破壞后早發(fā)性神經(jīng)元異常放電有關(guān)[21]，癲癇發(fā)作可發(fā)生在外傷后早期，但外傷性癲癇需在外傷后數(shù)月甚至數(shù)年才會(huì)發(fā)生[15]，然而早發(fā)性癲癇的出現(xiàn)卻可以大大增加患者發(fā)生晚發(fā)性癲癇的風(fēng)險(xiǎn)[22]。外傷性癲癇指外傷后1周出現(xiàn)的反復(fù)自發(fā)性癲癇發(fā)作，又稱遲發(fā)型癲癇，以區(qū)別1周內(nèi)發(fā)生的早發(fā)行癲癇或24h內(nèi)出現(xiàn)的即時(shí)發(fā)作性癲癇，但這種定義在動(dòng)物模型中尚未定義[8]。在人類外傷后早發(fā)性癲癇的發(fā)生率約為2.1%～16.9%，以兒童多見(jiàn)[2]。

血腦屏障破壞后引起血清白蛋白外滲到腦組織，血清白蛋白通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體被膠質(zhì)細(xì)胞攝取引起膠質(zhì)細(xì)胞激活和增生，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)興奮性增高，最終引發(fā)癲癇發(fā)作，而增生的異常星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持癲癇復(fù)發(fā)中起著重要作用。血腦屏障破壞在外傷性癲癇的發(fā)生、發(fā)展中扮演者重要角色，這對(duì)研究人類外傷性癲癇的機(jī)制有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)因樣本數(shù)量及觀察周期限制有其局限性，這需要進(jìn)一步去研究，膠質(zhì)細(xì)胞激活后究竟釋放何種因子及具體相關(guān)機(jī)制仍需做更深的探討。

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