固相萃取－UPLC－MS/MS測定食品中的黃曲霉毒素M1和B1*

肖麗恒，何學梅，李 萍，謝啟明

(1.楚雄州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 楚雄 675000;2.楚雄師范學院化學與生命科學系，云南 楚雄 675000)

黃曲霉毒素 (aflatoxin，簡稱為AF)是黃曲霉和寄生曲霉中產(chǎn)毒菌株的代謝產(chǎn)物，化學結(jié)構(gòu)均為二氫呋喃香豆素的衍生物，是目前為止所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的真菌毒素。普遍存在于霉變的糧食及糧食制品中，食用這些被污染的食物，直接影響人們的身體健康和生命安全。為了保證人身安全，國家規(guī)定的食品中允許含量極低［1］。

黃曲霉毒素的檢測分析方法有薄層色譜法 (TLC)［2］、高效液相色譜法 (HPLC)［3—6］、氣相色譜法 (GC)［2］、酶聯(lián)免疫法 (ELISA)、放射免疫檢測法［8］、以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法［9—13］，目前檢測黃曲霉毒素的方法比較廣泛的為免疫親和層析凈化高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫吸附法這兩種方法。TLC所需儀器設(shè)備簡單，干擾因素多，測定時間長，熒光強度的目測準確性比較差，主要是半定量;放射免疫法的樣品前處理提取方法簡便，具有靈敏度高，特異性強的特點，只能應(yīng)用于初篩分析［8］。目前的國標方法為免疫親和柱—液相色譜法，該方法靈敏度高，特異性好，但是存在免疫親和柱價格昂貴，需低溫保存，保存期短等缺點［9］。ELISA方法雖操作簡單、快速、經(jīng)濟，但有靈敏度較低、重復性較差、試劑壽命短、需要低溫保存等缺點［14］。因此，本文選擇乙腈提取，固相萃取純化作為前處理手段，UPLC－MS/MS檢測法作為檢測技術(shù)，建立了一種操作簡單、靈敏度高、特異性好、分析速度快、適用于食品中黃曲霉毒素檢測的檢測方法。

1.材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

安捷倫高壓液相色譜儀 (型號:1260)，系統(tǒng)配制:泵 (型號:G1312C)，電噴霧串聯(lián)雙重四級桿質(zhì)譜檢測器 (型號:6460)、自動進樣器 (型號:G1367E)、恒溫柱溫箱 (型號:G1316A)、真空在線脫氣機 (型號:G1322A)、化學工作站 (型號:MassHunterQQQ)、樣品均質(zhì)器、漩渦混合器 (或高速攪拌器)、高速離心機、氮氣吹干儀、超聲波清洗器、移液器、真空抽濾泵、EasyDI8超純水機。

1.2 材料與試劑

黃曲霉毒素M1標準儲備溶液 (10 μg/ml)、黃曲霉毒素B1標準儲備溶液 (10 μg/ml)、乙腈(色譜純)、甲醇 (色譜純)、甲酸 (色譜純)、乙酸 (色譜純)、甲酸銨 (色譜純)、乙酸銨 (色譜純)、氯化鈉 (分析純)、石油醚 (分析純)、三氯甲烷 (分析純)。次氯酸鈉溶液 (50 g/L)，SPE柱(ProElut AFT 1500 mg/12 mL)、0.45μm濾膜、一次性注射器。

1.3 色譜條件

色譜柱:ZORBAX Ecipse XDB－C18柱 (柱長100 mm，內(nèi)徑3.0 mm，填料直徑1.8 μm)，流動相:甲醇+0.1%甲酸水溶液 (60∶40);進樣量:5 μL;流速:0.4 mL/min，柱溫:45.0℃。

1.4 質(zhì)譜條件

離子化模式為電噴霧電離正離子模式 (ESI+);毛細管電壓為3.0kV(ESI+);去溶劑氣溫度為300℃;氮氣流速為10 L/min;碰撞氣壓力為40psi;掃描范圍為50～400 m/z，光電倍增器電壓增值為300 V;質(zhì)譜掃描模式為MRM模式。黃曲霉毒素的質(zhì)譜條件如表1。

表1 黃曲霉毒素M1、B1檢測的質(zhì)譜條件

1.5 樣品處理

1.5.1 樣品提取

準確稱取試樣2 g于50 mL離心管中，固體樣品加入5 mL水，非固體樣品不用加水，靜置10 min，加入20 mL乙腈，旋渦混合2 min，超聲提取20 min，加入飽和的氯化鈉溶液10 mL或者加入5 g氯化鈉，旋渦混合1 min，4000 rpm離心10 min，取出上清液，再加10 mL乙腈重復提取一次，合并兩次的上清液于試管中，在氮吹儀上45℃吹至近干，用2 mL乙腈溶解并旋渦混合1 min，等待凈化。

1.5.2 樣品凈化

用乙腈活化SPE小柱10 min。將待凈化液加入小柱，加2 mL乙腈潤洗試管，洗液加入小柱一起凈化處理，接收流出液。用20 mL乙腈洗脫，流速控制在1mL/min，洗脫液在45℃水浴中氮吹吹干，用精密移液器取1 mL流動相溶解，旋渦混合1 min，過0.45 μm的有機系濾膜，5 μL進樣上機檢測。

2.結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為了提高檢測器的靈敏度和使用性能，對質(zhì)譜檢測器的使用參數(shù)進行了調(diào)整和優(yōu)化，條件如1.4的設(shè)定，待儀器穩(wěn)定后，采用電噴霧電離正離子模式 (ESI+)MS1全掃描，掃描范圍為50～400(M/Z)，選出黃曲霉毒素M1和B1的母離子和優(yōu)化電離電壓，在對母離子進行碰撞解離并優(yōu)化碰撞能量，得出的參數(shù)如表1。

2.2 流動相的選擇

實驗時選用甲醇和水作為流動相，出峰時間好。但是為了更好地離子化，就在水溶液中加入甲酸，使甲酸的含量為0.1%。當甲醇和0.1%甲酸水溶液的比例為60:40(體積比，V/V)時，等度洗脫，黃曲霉毒素M1出峰時間為1.555 min，黃曲霉毒素B1出峰時間為2.104 min，分離效果較好，出峰時間比較合理，標樣含量為1.0 μg/L色譜圖如下圖1。

圖1 黃曲霉毒素M1、B1標樣色譜圖

2.2 萃取方式的選擇

黃曲霉毒素易溶于油、甲醇、乙腈、丙酮和氯仿等有機溶劑，但不溶于石油醚，己烷和乙醚中。利用甲醇和水作為樣品提取溶劑，在使用氯仿進一步提取，操作步驟多，使得回收率的測定結(jié)果偏低。于是選擇加適量的水和乙腈作為提取溶劑，在漩渦混合使其充分混合，采用超聲波超聲提取20 min，4000 rpm離心10 min，能夠充分的提取黃曲霉毒素，加入5 g氯化鈉，能很好的使乙腈和水相進行分離，上清液乙腈也有利于氮吹濃縮。

2.3 純化方法的優(yōu)化

黃曲霉毒素的凈化方法目前主要使用免疫親和柱 (IAC)進行凈化，其特點是將特異性的黃曲霉毒素單克隆抗體與載體蛋白偶聯(lián)并填柱而成。由于抗原抗體有一一對應(yīng)的特異性吸附關(guān)系，所以免疫親和柱 (IAC)只能特效性地、高選擇性地吸附黃曲霉毒素，而不讓其他雜質(zhì)通過柱子，使樣品得以純化。這種吸附又可以被極性有機溶劑洗脫，進行定量檢測，但是免疫親和柱存在價格昂貴，只能使用一次，需低溫保存，保存期短等缺點［9］。

另外，使用乙醚或者石油醚除脂，甲醇和水溶液提取，再用氯仿純化，方法雖然簡單，但是純化不完全，而且質(zhì)譜所用的色譜柱填料細，容易堵塞色譜柱和污染檢測器。使用固相萃取柱 (SPE)進行分離純化，其特點是它以極性、非極性及離子交換等幾類基團組成填充劑，可選擇性吸附樣液中的脂類、蛋白類等雜質(zhì)，黃曲霉毒素不被吸附而直接通過，從而達到凈化目的，并且價格合適，于是選用SPE柱進行凈化。

2.4 校準曲線和檢出限

將黃曲霉毒素標準儲備液按一定的濃度比例進行逐級稀釋，并配置成質(zhì)量濃度為1 μg/L、2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、50.0 μg/L的標準混合液，在設(shè)定好的檢測條件下，以峰面積和質(zhì)量濃度的關(guān)系繪制標準曲線。黃曲霉毒素M1在1μg/L～50 μg/L線性關(guān)系良好，黃曲霉毒素B1在1 μg/L～10 μg/L線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.999以上，線性回歸方程和檢出限如表2。

表2 黃曲霉毒素混合標準曲線回歸方程

2.5 樣品添加回收試驗和精密度

準確稱取2 g固體檢測樣品或5 g液體樣品，進行空白和加標實驗，加標物的含量為5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L，按實驗方法進行提取和凈化，制得加樣回收率供試品溶液進行UPLC－MS/MS檢測分析。并計算出回收率好和相應(yīng)RSD值，結(jié)果見表3，結(jié)果表明，此方法回收率試驗結(jié)果良好，滿足實驗方法要求。

表3 樣品中黃曲霉毒素添加回收率和精密度 (n=5)

3.結(jié)論

建立固相萃取與UPLC－MS/MS檢測食品中黃曲霉毒素M1和黃曲霉毒素B1的方法，具有操作簡單、靈敏度高、特異性好、分析速度快，滿足食品中黃曲霉毒素檢測的檢測方法。

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