高效液相色譜法測定醬油和食醋中4種對羥基苯甲酸酯

肖麗恒，呂任一，何學(xué)梅，謝啟明

(1.楚雄州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心，云南 楚雄 675000;2.楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000)

對羥基苯甲酸酯類是一種廣譜抑菌食品防腐劑，在食品生產(chǎn)、加工、儲存等過程中廣泛用于抑制微生物的繁殖，以防止食品腐敗變質(zhì)，延長食品保質(zhì)期［1—2］。但過量使用，會嚴(yán)重危害人的身體健康。我國對對羥基苯甲酸酯類防腐劑的使用量和殘留量上都有著十分嚴(yán)格的規(guī)定和要求，醬油、食醋中的最大使用量不超過0.25g/kg［3］。因此，為了確保人類身體健康和安全，建立快速、高效、高選擇性和高靈敏度的測定食品中對羥基苯甲酸酯類防腐劑的方法具有重要意義。

當(dāng)前，對羥基苯甲酸酯類防腐劑的測定方法主要有高效液相色譜法［4—9］、薄層色譜法［10—11］、毛細(xì)管電泳法［12］、氣相色譜法［13—17］、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法［18—19］等。其中，應(yīng)用比較廣泛的是高效液相色譜法和氣相色譜法，而薄層色譜法和毛細(xì)管電泳法應(yīng)用的相對較少，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測法檢測投入較多，應(yīng)用也不多。此外，對羥基苯甲酸酯類防腐劑有好多種，而且都在生活中廣泛使用［16—17］，這就需要開發(fā)出能同時檢測多種不同樣品中多種添加劑的測定方法［12—15］。因此，本文擬建立一種能夠快速、簡單、高效和準(zhǔn)確地同時測定醬油和食醋中4種對羥基苯甲酸酯的高效液相色譜法方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜系統(tǒng)LC－20A(日本島津公司)，配套二極管陣列檢測器SPD－M20A及色譜管理軟件LCsolution;輸液泵LC－20AB;自動進(jìn)樣器SIL－20AC;色譜柱柱溫箱CTO－20AC;去離子水純化系統(tǒng)EasyDI8(美國Millipore公司);漩渦混合器QL－861;超聲波清洗器AS20500AT;分析天平 (LA204、CPA225D);離心機 (凱達(dá)TG16G)。

乙腈為色譜純，乙酸銨、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉等試劑均為分析純。實驗用水均為超純水。

對羥基苯甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品 (美國Sigma公司):對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丙酯，純度≥99%。

1.2 色譜條件

色譜柱:Diamonsil－C18，粒度5μm，4.6mm×250mm(ID×L);檢測波長:254nm;流速:1.0mL/min;進(jìn)樣量:10μL;流動相A為乙腈，流動相B為乙酸銨緩沖液 (20mmol/L，并調(diào)節(jié)PH為4);柱溫:40℃。梯度洗脫程序如下表1:

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)貯備液和工作溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取25.0mg對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)品于4個25 mL容量瓶中，先用少量乙腈溶解后，再用乙腈定容至刻度。配制成1.00 mg/mL的單標(biāo)儲備液，冷藏保存。

用移液管準(zhǔn)確量取1mL各標(biāo)準(zhǔn)貯備液于10mL的容量瓶中，用乙腈定容到刻度，配制成100mg/L的中間液。

根據(jù)檢測的實際要求，取中間液根據(jù)不同的濃度，用流動相稀釋到相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，濃度系列:0.0 mg/L、7.5 mg/L、12.5 mg/L、25.0 mg/L、37.5 mg/L、50.0mg/L。

1.3.2 樣品準(zhǔn)備和處理

搖勻并稱取醬油或食醋樣品5 g(精確至0.01 g)，置于50 mL比色管中，加入1mon/L的氫氧化鈉溶液1 mL，加入適量的去離子水，漩渦混合1min，水浴超聲波輔助提取10 min，取出，加入2mL乙酸鋅和2mL亞鐵氰化鉀溶液混勻，調(diào)節(jié)pH至中性，用去離子水定容到50ml，慢速濾紙過濾，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后作為試液供高效液相色譜儀測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的確定

醬油食醋營養(yǎng)成分十分豐富，含有大量的醬色、蛋白質(zhì)及鹽類。如果直接過0.45um的濾膜進(jìn)行進(jìn)樣，會造成液相色譜柱的堵塞。因此，色譜分離前，須對樣品進(jìn)行凈化處理，以除去多余的雜質(zhì)，保護色譜柱，延長使用壽命。如用甲醇或者乙醇提取，樣品中所含雜質(zhì)較多，且甲醇有一定的毒性。而乙酸鋅－亞鐵氰化鉀是蛋白質(zhì)以及其它大分子極性物質(zhì)的經(jīng)典的沉淀試劑［9］，而且廣泛運用于食品分析中，且使用方便。所以，本實驗采用乙酸鋅－亞鐵氰化鉀作沉淀劑，同時加1mL1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至中性，處理效果十分滿意。

2.2 流動相的選擇

為了選擇合適的檢測條件，分別對甲醇－水、甲醇－乙酸銨緩沖液、乙腈－水和乙腈－乙酸銨緩沖液四種流動相體系進(jìn)行了試驗。結(jié)果顯示，使用乙腈－水流動相、甲醇－水流動相體系，在相同的試劑配比下，分析時間明顯太長。而選擇甲醇－乙酸銨緩沖液流動相體系，分析時間也較長。在同等條件下選擇乙腈－乙酸銨緩沖液作為流動相，它能較好地分離四種對羥基苯甲酸酯類，而且能有效地縮短總分析時間。實驗表明，當(dāng)乙腈體積分?jǐn)?shù)為30%時為初始的流動相最為適合，分離效果好，而且保留時間合適。

2.3 檢測波長的選擇

對羥基苯甲酸酯的吸收光譜波長分別為在226nm，248nm，257nm，255nm，256nm，253nm處表現(xiàn)高靈敏度［4—9］，但是，我們在進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)，在波長254nm靈敏度相對更好，因此選擇254nm作為實驗的最佳檢測波長。

2.4 方法的評價

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍和最低檢測限確定

對羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液通過高效液相色譜采用1.2的檢測條件進(jìn)行檢測分析，色譜圖如圖1所示。

圖1 四種對羥基苯甲酸酯類標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.1 Chromatograms of 4 p－h(huán)ydroxybenzoates standards

實驗結(jié)果表明，在乙腈－乙酸銨緩沖液為流動相條件下，各組分保留時間和分離效果都較好。用各組分的峰面積與質(zhì)量濃度的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行線性回歸分析，其中Y代表峰面積，X代表進(jìn)樣質(zhì)量濃度，得出相應(yīng)回歸方程和相關(guān)系數(shù)。并且，對羥基苯甲酸酯在0.0～50.0 mg/L時，有著良好的線性關(guān)系。在此實驗條件下，對羥基苯甲酸酯類以5倍基線噪聲所對應(yīng)的濃度作為方法的最低檢測限。根據(jù)信噪比 (S/N=5)計算，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸異丙酯、對羥基苯甲酸丙酯的檢測限分別為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.25 mg/kg、0.2 mg/kg。本方法的線性回歸方程和檢出限如表2所示。

表2 對羥基苯甲酸酯的線性回歸方程和檢出限Table 2 Linear regression equation and detection limits of p－h(huán)ydroxybenzoates

2.4.2 準(zhǔn)確度和精密度

選取醬油、食醋樣品，分別按表3添加水平進(jìn)行加標(biāo)回收實驗，同時做樣品空白實驗，空白結(jié)果如圖3所示。

樣品經(jīng)過處理后，通過高效液相色譜儀進(jìn)行測定。樣品中對羥基苯甲酸酯類加標(biāo)回收的HPLC檢測，結(jié)果如圖4所示。

圖3 醬油樣品色譜圖Fig. 3 Chromatograms of a soy sauce

圖4 醬油中添加4種對羥基苯甲酸酯色譜圖Fig.4 Chromatograms of soy sauce added with 4 p－h(huán)ydroxybenzoates standards

對樣品在同一天內(nèi)每一濃度進(jìn)行平行測定6次，采用外標(biāo)法對樣品加標(biāo)進(jìn)行校正，取平均值計算回收率和精密度，結(jié)果見表3。實驗表明，本方法加標(biāo)回收率比較穩(wěn)定 (86.3% ～101.6%)，不同樣品在不同加標(biāo)水平上的回收率比較穩(wěn)定。不同濃度的對羥基苯甲酸酯在醬油、食醋樣品中的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.9%～3.1%和0.7%～2.9%，結(jié)果見表4。精密度滿足醬油和食醋中對羥基苯甲酸酯類含量的分析要求。

表3 醬油和食醋中對羥基苯甲酸酯的加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果 (n=6)Table 3 Recoveries and precisions of p－h(huán)ydroxybenzoates in soy sauce and vinegar(n=6)

p－Hydroxybenzoates Added/(mg/kg)Average recovery/%soy sauce vinegar RSD/(%)soy sauce vinegar 593.3 92.3 3.1 2.3 IPP 10 94.5 97.7 1.8 1.215 99.1 99.5 1.9 1.6586.3 90.3 2.7 2.9 PP 10 97.6 101.6 1.7 2.415 99.5 99.3 0.9 1.1

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法測定醬油、食醋中四種對羥基苯甲酸酯類物質(zhì)含量的方法。樣品經(jīng)過處理后，對羥基苯甲酸酯在0.0～50.0mg/L時，有著良好的線性關(guān)系，r=0.9999，四種對羥基苯甲酸酯的檢出限可達(dá)到0.1～0.25mg/kg(S/N=3)。該方法效果穩(wěn)定，操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，為醬油、食醋中對羥基苯甲酸酯類物質(zhì)的檢測提供了一種新的快速、有效的檢測方法。

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