內(nèi)皮祖細(xì)胞磁性標(biāo)記及MR示蹤在大鼠腦膠質(zhì)瘤血管生成研究中的應(yīng)用

陳偉志 (遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121001)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見腫瘤之一，生長(zhǎng)速度快且復(fù)發(fā)性強(qiáng)〔1〕。腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲依賴于腫瘤的血管生長(zhǎng)，而血管內(nèi)皮祖細(xì)胞可參與腫瘤血管的新生〔2〕。因此，近年來對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞參與腫瘤血管新生的過程有大量的研究?；铙w示蹤細(xì)胞是分子影像學(xué)的重要方法之一，能有效動(dòng)態(tài)觀察機(jī)體的內(nèi)部變化〔3〕。有研究使用超微超順磁性氧化鐵(USPIO)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記并通過磁共振成像(MR)示蹤〔4〕，而內(nèi)皮祖細(xì)胞磁性標(biāo)記及MR示蹤并無相關(guān)報(bào)道。本研究采用USPIO進(jìn)行大鼠腦膠質(zhì)瘤血管生成過程中的內(nèi)皮祖細(xì)胞磁性標(biāo)記及MR示蹤。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 提取細(xì)胞動(dòng)物選取雄性SPF級(jí)SD大鼠4只，體重(100±10)g;觀察動(dòng)物選取雄性SPF級(jí)SD大鼠16只，體重(300±50)g;膠質(zhì)瘤細(xì)胞株選取C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株系。

1.2 方法

1.2.1 骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞分離 首先將體重(100±10)g SD大鼠處死，提取骨髓來源的單核細(xì)胞，EGM-2培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，條件為37℃，5%CO2濃度，培養(yǎng)14 d左右進(jìn)行傳代，所得即為骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞。

1.2.2 USPIO-QDs雙標(biāo)記 將25 μg/ml的磁性標(biāo)記 USPIO與0.5 μg/ml的多聚賴氨酸混合，并與EGM-2培養(yǎng)基混勻，37℃下孵育24 h。將已磁性標(biāo)記和未磁性標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞，加入2%亞鐵氰化鉀與6%鹽酸，進(jìn)行Prussian blue染色，以觀察對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的標(biāo)記率。USPIO標(biāo)記后，使用Qtracker565 cell labeling試劑盒對(duì)其進(jìn)行量子點(diǎn)(QDs)熒光標(biāo)記。將1 μl PBS緩沖液和波長(zhǎng)為565 nm的QDs與0.2 ml EGM-2培養(yǎng)基混合，共同孵育24 h后，加入 Qtracker565 cell labeling培養(yǎng)液，37℃下孵育1 h。PBS清洗5次后，進(jìn)行Prussian blue染色，并在光鏡下觀察。

1.2.3 腦膠質(zhì)瘤模型的建立 使用腦立體定位儀對(duì)SD大鼠進(jìn)行右側(cè)基底節(jié)區(qū)定位微注射，于冠狀縫前1 mm、中線右旁開3 mm、深 5 mm 注射 C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞懸液 10 μl，速度 1 μl/min。

1.2.4 USPIO-QDs雙標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞的移植 膠質(zhì)瘤細(xì)胞注射大鼠5 d后，使用磁共振進(jìn)行掃描并觀察瘤體生長(zhǎng)情況，2 d后進(jìn)行內(nèi)皮祖細(xì)胞移植。將16只SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組8只，實(shí)驗(yàn)組通過尾靜脈注射USPIO-QDs內(nèi)皮祖細(xì)胞懸液1 ml，對(duì)照組通過尾靜脈注射未標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞懸液1 ml。

1.2.5 MR示蹤腦膠質(zhì)瘤內(nèi)USPIO-QDs內(nèi)皮祖細(xì)胞 分別于移植內(nèi)皮祖細(xì)胞前2 d及移植后1、2、4 d后進(jìn)行3.0 T MR掃描，主要包括 T1WI、T2WI、T2*map 掃描;T1WI掃描 TR=400 ms、TE=9.5 ms，T2WI 掃描 TR=2 000 ms、TE=46 ms，T2*map掃描 TR=120 ms、TE=2.8 ～35.4 ms。

1.2.6 大鼠腦組織切片熒光顯微鏡觀察 將USPIO-QDs雙標(biāo)記移植細(xì)胞2、4 d后的大鼠鼠尾靜脈注射1 mg/ml德克薩斯紅標(biāo)記的番茄凝集素0.5 ml，處死大鼠并進(jìn)行腦組織冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察腫瘤的新生血管生成。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的USPIO-QDs標(biāo)記 分別對(duì)USPIO磁性標(biāo)記和未標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行Prussian blue染色，發(fā)現(xiàn)磁性標(biāo)記的細(xì)胞胞漿內(nèi)顯示藍(lán)色，而未標(biāo)記細(xì)胞則無藍(lán)色顯示。使用波長(zhǎng)為565 nm的QDs與內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行孵育，隨后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞顯示綠色熒光，發(fā)光位置在胞漿內(nèi)部，說明USPIO-QDs可以對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行雙標(biāo)記。見圖1。

圖1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的USPIO-QDs標(biāo)記

圖2 MR示蹤對(duì)照組大鼠未磁性標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞

2.2 MR示蹤磁性標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞 在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種7 d后，向?qū)嶒?yàn)組和對(duì)照組的大鼠移植磁性標(biāo)記和未標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞，分別對(duì)其進(jìn)行MR掃描。由圖2可見，對(duì)照組大鼠右側(cè)基底節(jié)區(qū)顯示等T1長(zhǎng)T2的信號(hào)，可見瘤體的強(qiáng)化，T2*map序列下腫瘤區(qū)見線狀針道信號(hào)，腫瘤組織在T2*map序列未見明顯異常的信號(hào)。

圖3顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠磁性標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞移植前2 d，T1WI沒有顯示出明顯的異常信號(hào)，T2*map可見稍低信號(hào)，可能為針道信號(hào);移植24 h后，T1WI右側(cè)基底節(jié)區(qū)呈現(xiàn)稍高的信號(hào)，T2WI和T2*map掃描下發(fā)現(xiàn)瘤周間斷線狀低信號(hào);48 h及4 d后的磁共振掃描均可見瘤周的低信號(hào)存在，但低信號(hào)有消散的趨勢(shì)，說明內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移至腫瘤后開始增殖和分化。此結(jié)果顯示，磁性標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞向瘤體遷移的過程可以被MR所示蹤。

2.3 內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移顯示腫瘤新生血管生成 將注射德克薩斯紅標(biāo)記的番茄凝集素后死亡的大鼠進(jìn)行腦組織冰凍切片，熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移到腫瘤組織，并且分布在腫瘤的邊緣，顯示綠色熒光;紅色熒光顯示番茄凝集素標(biāo)記的腫瘤新生血管。對(duì)圖片進(jìn)行merge發(fā)現(xiàn)兩種熒光存在共定位，說明內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移至腫瘤后參與了新生血管的生成。Prussian blue染色顯示，QDs綠色熒光與Prussian blue陽性細(xì)胞處在同樣位置，說明此為USPIO-QDs雙標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證了內(nèi)皮祖細(xì)胞參與新生血管生成的可能性。見圖4。

圖3 MR示蹤實(shí)驗(yàn)組大鼠磁性標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞

圖4 內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移顯示腫瘤的新生血管生成

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，骨髓內(nèi)部的內(nèi)皮祖細(xì)胞可以分化為血管的內(nèi)皮細(xì)胞〔5〕，在成體的血管新生中起重要的作用，成為近年來研究的熱點(diǎn)，不僅為血管新生的機(jī)制研究提供了新途徑，并為血管損傷、惡性腫瘤等的臨床治療提供了新思路和方法〔6〕。而血管生成在機(jī)體生理和病理過程中都起著重要作用〔7〕，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲等都依賴于血管的生成，而內(nèi)皮祖細(xì)胞則在腫瘤分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子作用下運(yùn)動(dòng)到外周血，參與腫瘤血管的生成〔8〕。因此，如何觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞參與腫瘤血管形成的過程是抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲的前提之一〔9〕。

隨著分子影像學(xué)的快速發(fā)展，活體觀察組織的變化成為目前研究的熱點(diǎn)，通過標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行MR示蹤對(duì)于觀察機(jī)體的代謝和變化有其獨(dú)特的優(yōu)越性。目前標(biāo)記干細(xì)胞的MR對(duì)比劑主要分為兩種:(1)順磁性對(duì)比劑，如常見的Gd螯合劑，通過產(chǎn)生T1正性對(duì)比效應(yīng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記;(2)單/多晶體氧化鐵為基礎(chǔ)的對(duì)比劑，較強(qiáng)的T2負(fù)性對(duì)比效應(yīng)標(biāo)記細(xì)胞，其優(yōu)點(diǎn)在于穿透力較強(qiáng)，低濃度即可形成磁共振的對(duì)比〔10〕。USPIO即為其中常用的對(duì)比劑之一，能夠產(chǎn)生較大的順磁性，在自旋回波和梯度回波序列時(shí)形成低信號(hào)區(qū)而成像〔11〕。本研究說明磁性標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞向瘤體遷移的過程可以被MR所示蹤。

通過鼠尾靜脈注射德克薩斯紅標(biāo)記的番茄凝集素，可確認(rèn)雙標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞向瘤體遷移，并且分布在腫瘤的邊緣，而熒光共定位也顯示雙標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞參與了腫瘤血管的生成，因此，MR示蹤展示了內(nèi)皮祖細(xì)胞從移植到參與腫瘤血管生成的中間過程，并有可能繼續(xù)觀察后續(xù)的進(jìn)程。

綜上所述，USPIO對(duì)于內(nèi)皮祖細(xì)胞磁性標(biāo)記和MR示蹤是一種有效的標(biāo)記物，而MR也是活體示蹤觀察USPIO標(biāo)記的腦膠質(zhì)瘤血管生成的有效手段。隨著MR發(fā)展速度的加快和更多示蹤劑的研發(fā)，無創(chuàng)、動(dòng)態(tài)觀察越來越受到重視。在臨床觀察與基礎(chǔ)研究中，USPIO磁性標(biāo)記和MR示蹤會(huì)得到越來越廣泛的應(yīng)用。

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