FGF21在高山紅景天甙治療糖尿病腎小球硬化中的作用

高文慧 徐 鋒 吳 曼 韓洪波 羅 萍 孫廣東 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院腎病內(nèi)科，吉林 長春 3004)

糖尿病腎病(DN)是中老年患者導(dǎo)致終末期腎衰竭的首要病因〔1〕。腎小球硬化是晚期 DN的病理特征，細胞外基質(zhì)(ECM)積聚是腎小球硬化發(fā)生的基礎(chǔ)，纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)在腎小球硬化中發(fā)揮重要作用〔2〕。成纖維細胞生長因子(FGF)21屬于FGF家族新成員，可以調(diào)節(jié)血脂代謝，降低血糖并保護胰腺β細胞的數(shù)量及功能，不會引起低血糖。生酮飲食飼養(yǎng)的小鼠可以通過過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)途徑誘導(dǎo)FGF21的表達增加，而腎組織中的PAI-1表達略呈下降趨勢，與FGF21的高表達呈負相關(guān)〔3〕。高山紅景天甙(SS)來自長白山地區(qū)珍稀藥用植物高山紅景天，早期研究認為SS可以降低阿霉素腎病大鼠腎組織PAI-1水平，起到延緩腎小球硬化進展的作用〔4〕。本實驗觀察SS治療糖尿病大鼠對于FGF21 mRNA的影響，探討其是否可以通過影響腎小球PAI-1的表達水平從而起到延緩腎小球硬化的作用。

1 材料與方法

1.1 動物和分組 成年雄性Wistar大鼠24只，體重220～240 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分為正常對照組(NC組)、肥胖組(OB組)、糖尿病組(DM組)和SS組。

1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ):美國Sigma公司;考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒:南京建成生物工程研究所;增強化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒:美國PIERCE公司;PAI-1(612024)抗體:美國BD生物公司提供;RNA STAT-60試劑:美國Tel-Test Inc公司;PAI-1、FGF21引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成;RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，SYBR Green PCR試劑:日本Takara公司。

1.3 主要儀器 血糖分析儀、血糖試紙條:美國羅氏公司;O-lympus BX40顯微鏡:日本Olympus公司;Thermo Shandon半自動石蠟切片機:英國Shandon公司;圖像分析系統(tǒng):北京航天航空大學(xué);DYY-8C電泳儀、DYCP-40C型干板轉(zhuǎn)移槽:北京市六一儀器廠。7300系列實時熒光定量PCR系統(tǒng):愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易有限公司(上海)。

1.4 方法

1.4.1 SS的制備 高山紅景天5 kg磨成細末，以70%乙醇浸泡24 h后蒸餾至無乙醇，加等量石油醚混勻后靜置分層，取水層，依次以氯仿、乙酸乙酯及正丁醇萃取3次，獲得水層經(jīng)蒸餾濃縮，752紫外分光光度計掃描，與標(biāo)準(zhǔn)品進行比較，得濃縮液500 ml于4℃冰箱內(nèi)貯藏備用。

1.4.2 模型制作 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按照文獻進行糖尿病模型制備〔5〕，NC組(n=6)給予普通飲料，自由飲水。OB組、DM組和SS組大鼠給予高脂顆粒飼料(n=6)。8 w后，DM組及SS組大鼠空腹12 h后給予低劑量STZ(30 mg/kg)單次腹腔注射，NC組及OB組大鼠給予單次腹腔注射等量枸櫞酸鈉緩沖液。7 d后大鼠尾靜脈取血測血糖及尿糖試紙條檢測尿糖，血糖濃度＞16.7 mmol/L、尿糖～為DM模型成功，未達到標(biāo)準(zhǔn)的大鼠被剔除。

1.4.3 給藥方法 自造模成功后動物飼養(yǎng)4 w后開始給藥治療。SS組大鼠給予SS液1.5 ml(0.5 ml原藥+1.0 ml生理鹽水，相當(dāng)于生藥20 g·kg-1·d-1)每日1次，連續(xù)灌胃8 w，NC、OB及DM組大鼠均同時給予等量生理鹽水灌胃。

1.4.4 標(biāo)本收集 試驗前、中不同時間點及試驗終點均代謝籠收集大鼠24 h尿液用于檢測尿蛋白;試驗前、中不同時間點及試驗終點大鼠尾靜脈采血測血糖;試驗終點大鼠心臟取血后取腎:左腎下極腎組織10%甲醛固定用于組織學(xué)檢測，其余腎組織分裝若干于-70℃凍存以提取總RNA及蛋白，右腎用于提取腎小球，肝組織若干于-70℃凍存以提取總RNA。

1.4.5 分離腎小球 應(yīng)用篩網(wǎng)法提取大鼠腎小球。新鮮腎臟稱重后去包膜，切碎，置于孔徑200、150、75 μm篩網(wǎng)中(自上而下)，4℃充分研磨后PBS緩沖液反復(fù)沖洗，收集底層75 μm篩網(wǎng)存留的腎小球，1 500 r/min離心5 min，棄去上清后分裝在1.5 ml EP管中-70℃凍存，用于提取腎小球mRNA和蛋白。

1.4.6 指標(biāo)檢測 考馬斯亮藍法測定尿蛋白定量;羅氏血糖分析儀檢測血糖;自動生化分析儀檢測血漿白蛋白(ALB)、肌酐(Scr)、總膽固醇(CHO)及甘油三酯(TG)水平;PAS染色觀察腎臟病理改變;Western印跡檢測腎小球PAI-1蛋白表達水平;實時定量PCR檢測腎小球PAI-1、肝臟FGF21 mRNA表達，應(yīng)用β-actin為內(nèi)參以2-ΔΔCt公式計算mRNA相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用PRISM統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組間行t檢驗，多組間行ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 SS對糖尿病及DN的治療作用 與NC組大鼠比較，OB組大鼠體重、TG明顯升高(P＜0.05);DM組大鼠血糖、體重、血脂及24 h尿蛋白較NC組明顯升高(P＜0.05)，而血中ALB顯著降低(P＜0.05)。SS治療可明顯降低血糖、血脂及24 h尿蛋白定量(P＜0.05)，而ALB水平顯著升高(P＜0.05);同時PAS染色發(fā)現(xiàn)DM組大鼠腎小球系膜區(qū)增寬程度較NC組大鼠明顯增加，SS能夠明顯減輕糖尿病時腎小球系膜區(qū)的變化。見表 1，圖 1。

表1 高山紅景天甙對糖尿病大鼠體重、血糖、血脂及24 h尿蛋白定量的影響(±s ，n=6)

表1 高山紅景天甙對糖尿病大鼠體重、血糖、血脂及24 h尿蛋白定量的影響(±s ，n=6)

與NC組比較:1)P＜0.05;與DM組比較:2)P＜0.05

組別 體重(g) 血糖(mmol/L) CHO(mmol/L) TG(mmol/L) ALB(g/L) 尿蛋白定量(mg)NC 436.6±16.2 7.4±0.45 1.33±0.12 0.75±0.14 33.73±3.19 3.0±1.26 OB 560.1±27.41) 7.8±0.36 2.40±0.45 1.58±0.201) 34.67±1.78 4.0±1.03 DM 501±13.61) 26.0±1.101) 2.62±0.591) 1.69±0.241) 20.7±1.971) 75.9±14.851)SS 513.7±13.71) 20.2±1.261)2) 1.88±0.151)2) 1.47±0.101)2) 25.82±1.401)2) 61.2±10.71)2)

圖1 高山紅景天甙對各組大鼠腎小球硬化的影響(PAS，×400)

2.2 SS對PAI-1的影響 DM組大鼠腎小球中PAI-1 mRNA(5.31±0.59)及蛋白質(zhì)(2.50±0.21)表達水平較 NC組(1.00±0.10，1.00±0.08)及 OB 組(1.07±0.19，1.33±0.09)顯著升高(P＜0.05)，SS治療可明顯降低腎小球中PAI-1 mRNA(2.55±0.09)及蛋白(173.0±0.09)水平(P＜0.05)，PAI-1的變化與各組大鼠腎小球系膜基質(zhì)沉積的趨勢相同。見圖2。

2.3 SS對FGF21表達的影響 高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病大鼠肝臟組織中FGF21 mRNA水平(4.93±0.83)較 NC組(1.01±0.14)顯著增加(P＜0.05)，OB組FGF21 mRNA水平為1.42±0.58;而SS治療后該組大鼠肝臟FGF21 mRNA的水平(7.24±0.99)較DM組進一步升高(P＜0.05)，與血糖的下降及PAI-1表達變化呈負相關(guān)。

圖2 高山紅景天甙對腎小球中PAI-1水平的影響

3 討論

一部分糖尿病患者在發(fā)生代謝異常平均15年后會進展為DN，早期表現(xiàn)為腎小球基底膜增厚、輕度系膜增寬及小動脈透明樣變性，1型及2型糖尿病患者有較多的相似性，最終形成顯著的系膜基質(zhì)增加導(dǎo)致KW結(jié)節(jié)形成〔6〕，上述病變的病理基礎(chǔ)是ECM積聚，而PAI-1在引起ECM積聚致DN的過程中起到?jīng)Q定性作用〔7〕，抑制PAI-1活性可緩解DN的進展〔2〕。本研究的結(jié)果顯示PAI-1在DM組中高表達，與大鼠24 h尿蛋白定量增加及腎臟ECM沉積的增加趨勢相同，與文獻報道一致，經(jīng)過SS治療可使腎臟ECM沉積減少及大鼠24 h尿蛋白定量降低，與PAI-1的表達下降密切相關(guān)，表明SS可以通過下調(diào)腎小球PAI-1高表達改變腎臟功能。

FGF21主要在肝臟及骨骼肌中表達，大多數(shù)來自鼠類的動物實驗表明，F(xiàn)GF21可以通過脂肪組織和胰腺減輕肥胖相關(guān)的高血糖及高脂血癥，另外，F(xiàn)GF21對于饑餓和酮癥也有重要的調(diào)節(jié)功能，尚無人類的體內(nèi)實驗資料，僅從幾種人類細胞實驗得出的結(jié)果顯示，雖然目前被視為治療2型糖尿病的新型潛在因素，但FGF21治療糖尿病的確切機制尚未闡明〔8〕。生酮飲食可以間接誘導(dǎo)小鼠肝臟FGF21表達增加并降低腎臟組織PAI-1表達〔3〕，這是目前唯一FGF21影響PAI-1表達的依據(jù)。本實驗結(jié)果表明，DM組大鼠肝臟組織中的FGF21 mRNA表達增加，是高血糖及肥胖在疾病初期刺激的結(jié)果。FGF21基因表達上調(diào)在發(fā)揮降脂及降糖作用的同時，尚不能單獨阻止腎小球中PAI-1基因的高表達。而SS治療組大鼠中的FGF21 mRNA表達較DM組進一步升高，在更高的表達水平可以部分參與腎小球中PAI-1基因的表達下調(diào)，緩解糖尿病組大鼠的腎臟病理變化，F(xiàn)GF21與PAI-1基因表達在疾病后期呈負相關(guān)趨勢。

本問題組前期研究結(jié)果顯示，高山紅景天主要有效成分SS(C14H20O7)除了具有抗氧化、抗衰老及雙向免疫調(diào)節(jié)作用外，還可以降低阿霉素大鼠的尿蛋白定量、CHO水平，并且可以升高ALB水平〔9〕。而本研究的結(jié)果顯示SS具有在降低糖尿病大鼠血糖、血脂水平及尿蛋白定量等作用的同時，升高ALB水平，起到治療DN的作用。同時觀察到SS可以緩解糖尿病組大鼠的腎小球硬化，考慮與其對糖尿病腎小球硬化有決定性作用的PAI-1表達有一定程度的抑制作用有關(guān)，而SS對PAI-1高表達的抑制作用考慮有以下兩種機制:(1)SS可以增加FGF21基因的表達，進而直接降低PAI-1在腎臟的表達水平;(2)SS治療糖尿病大鼠引起FGF21進一步上調(diào)，通過其降低血糖及血脂水平的作用間接影響PAI-1在腎臟中的表達。SS通過上述兩種途徑起到延緩腎小球硬化及保護腎臟功能的作用。由于目前研究資料有限，SS影響FGF21基因表達以調(diào)控腎小球中PAI-1基因變化的確切機制尚須進一步研究證實。

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