腎活檢標本的制備

孫 璟，武芳芳，郎冬梅

腎活檢病理不同于常規(guī)病理，除了光學顯微鏡外，還需要借助免疫病理和電鏡的觀察，才能作出病理診斷。在腎穿刺活檢標本制片過程中，組織的前期處理對標本制作的效果起著關鍵性作用[1]。根據(jù)筆者所在科近年來50例腎活檢標本制備體會進行分析，現(xiàn)將在長期實踐中摸索出來的一套較好的制備方法介紹如下。

1 標本取材前準備

腎活檢標本要進行3種病理檢查，因此取出腎標本后就立即分為3部分送檢。各種標本固定液均應在穿刺前按不同檢視方法置于干凈的小瓶內(nèi)待用。①光鏡：清潔的5 ml小瓶，裝滿FAA混合固定液（配方為10%甲醛10 ml、冰醋酸5 ml和90%乙醇溶液85 ml）蓋緊常溫保存；②免疫熒光：清潔的5 ml小瓶，瓶中放入浸濕生理鹽水的紗布，冰桶內(nèi)保存?zhèn)溆?；③電鏡：清潔的1 ml的離心管，加滿2%的戊二醛蓋緊置冰桶內(nèi)保存?zhèn)溆肹2]。

2 標本的判斷與分割

腎穿刺一般應用穿刺針在B超定位下進行。一次可獲取1.0～1.5 cm腎組織。肉眼觀腎組織髓質(zhì)顏色暗紅，皮質(zhì)稍淺；在放大鏡下，皮質(zhì)部分可見到腎小球呈小紅點結(jié)構(gòu)，放入固定液中，可沉于瓶底。另外，在取材時應注意標本的鑒別，如肌肉組織的顏色與腎組織的顏色相似，相對密度也和腎組織差不多，但其看不到腎皮質(zhì)小紅點。脂肪組織呈黃白色，相對密度小，漂浮于固定液表面。結(jié)締組織呈灰白色，較腎組織質(zhì)地柔韌，不易切割。如發(fā)現(xiàn)無腎小球或不是腎組織，則應重新穿刺取材。

常規(guī)在確定為腎組織標本后，應立即分割進行光鏡、免疫熒光或電鏡檢查。操作中需注意標本未固定時，攝取標本動作一定要輕，切勿擠壓，避免人為破壞腎組織結(jié)構(gòu)，應在短時間分切標本，不宜過長時間將標本暴露在空氣中或強光下，以保持標本的濕潤性，否則標本將會縮小、干枯。方法如下：將腎穿刺標本輕輕放在軟木板上，分清皮質(zhì)端和髓質(zhì)端，用鋒利的小刀進行切割，自皮質(zhì)端切下1～2 mm（分配1～2個腎小球）供電鏡檢查用，依次再切下3～4 mm（分配1～5個腎小球）供免疫熒光檢查用，其余大部分（分配不少于10個腎小球）供光鏡檢查，如取材標本較少，應先滿足染色光鏡標本，其次為免疫病理標本。筆者所在科一般制作冰凍切片7～8 張，厚度為 3～4 μm，做 IgG、IgA、IgM、C3、Clq、C4 等抗體檢查，石蠟包埋切片 2～3 μm， 分別做常規(guī) HE染色，PAS，Masson、PASM以及剛果紅和甲基紫等特殊染色。

標本分割后應立即放于事先準備好的容器內(nèi)，做免疫熒光的標本，放在經(jīng)生理鹽水浸溫的紗布上，連同紗布置于干凈容器內(nèi)，及時經(jīng)OTC包埋劑包埋切片。光鏡標本即放進FAA混合固定液內(nèi)，電鏡標本立即放入2.5%戊二醛內(nèi)于4℃冰箱內(nèi)固定。標本裝瓶后應及時加蓋，并在瓶上寫清患者姓名、科室及床號。若未能及時送檢標本應置于冰箱中保存待檢。

3 標本的具體制備方法

3.1 免疫熒光的制片 方法是腎臟病理學中最重要的方法，最好用冷凍切片機，冷凍切片的腎組織新鮮，抗原保存良好，若暫時不能切片，應將標本放在-70℃低溫冰箱內(nèi)保存。將標本置于冷凍切片機的冷凍頭上，加少許OTC包埋劑，于冷室內(nèi)-20℃切片，厚度要求3～4 mm附貼于載玻片上需要10片以上備用。光鏡觀察切片有無腎小球（不染色），如有腎小球，則視需要選擇相應抗體的種類，切出相應數(shù)量的片子，剩余腎組織放入冰箱備用。

3.2 石蠟包埋制備方法 組織的固定：腎組織在固定液內(nèi)于室溫下固定45 min。脫水、透明、浸蠟、包埋：①梯度酒精脫水，以70%-80%-90%-無水乙醇，每梯 2缸，每缸 20 min，二甲苯透明，分2缸，每缸10 min；②浸蠟包埋：優(yōu)質(zhì)石蠟（58～62℃）2缸，每缸30 min后包埋。切片：修理蠟塊，置于冰箱預冷40 min，在切片機上切出2～3 μm的切片。在實踐中發(fā)現(xiàn)石蠟切片時需要注意室溫不能過高，應保持在25～28℃之間，否則蠟塊易溶，不易制片。

3.3 電鏡標本制備方法 ①取材：標本要求含有腎小球；②固定：標本立即放入2.5%戊二醛內(nèi)于4℃冰箱內(nèi)固定4 h后入0.05 mol/L磷酸緩沖液沖洗3 h，再入1%鋨酸于室溫下固定1 h；③脫水包埋：依次用50%-65%-75%-85%-95%-無水乙醇脫水，30 min/次；氧化丙烯酸浸透 3 次，15～30 min/次；浸透：浸透1 h；固化，使之聚合變硬，呈淡黃色透明塊狀；④超薄切片：將包埋塊修整，用切片機制成超薄片[2]。許多類型的腎小球疾病診斷必須以電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)或免疫電鏡結(jié)果，才能得出正確診斷。

圖1 光鏡標本

圖2 冰凍標本

4 結(jié)果

筆者所在科所處理的98%左右的腎穿刺標本都能確保光鏡（圖 1）、冰凍（圖 2）、電鏡（圖 3）標本都有腎小球。 按上述程序操作的特殊染色對比鮮艷，效果好，完全可以滿足病理診斷。

圖3 電鏡標本

5 體會

結(jié)合50例腎穿刺活檢病理標本制備情況，現(xiàn)總結(jié)體會如下：首先要進行腎活檢標本的判斷和辨認，因腎穿組織較普通病理體積較小，組織塊一定要包好。其次組織在標本分割時要注意動作要輕柔，切片刀要鋒利，切片要平整。再次，標本根據(jù)需要選擇固定液進行固定。在此需要注意的是固定液應為標本體積的10倍。標本裝瓶后應及時加蓋。最后，進行切片。在標本制片過程中，組織的前期處理對組織制片的效果起到關鍵作用。所以，在腎穿刺活檢組織標本制片中一定要掌握時間，才能保證做出良好的腎臟病理切片，更好的為臨床醫(yī)師診斷提供幫助。

[1]鄒萬忠.腎活檢病理診斷標準指導意見[J].中華腎臟病雜志，2001，17（3）：270-275.

[2]王伯沄，李玉松，黃高昇，等.病理學技術[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.948-952.

[3]龔志錦.病理組織制作和染色技術[M].上海：上海科學技術出版社，1994.359.