水生生物體內(nèi)抗氧化酶及其影響因素研究進展

亢玉靜，郎明遠(yuǎn)，趙 文

(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院遼寧省水生生物學(xué)重點實驗室，遼寧大連 116023)

生物體在正常的新陳代謝過程中，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生少量的自由基，參與了機體內(nèi)多種生理過程(如機體防衛(wèi)、某些物質(zhì)的合成等)，具有重要的生理功能。但是在病理或逆境下，體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧大量積累，打破了細(xì)胞內(nèi)原有的動態(tài)平衡狀態(tài)，將會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷，必須及時將其清除。在長期的進化過程中，生物體內(nèi)產(chǎn)生了一些物質(zhì)能夠清除體內(nèi)的活性氧，其中起重要作用的是抗氧化酶類。

1 活性氧自由基的來源及其作用

所有的需氧生物在新陳代謝過程中，體內(nèi)細(xì)胞都會產(chǎn)生一定的自由基(free radical)，即具有不成對電子的分子、原子、離子和基團。其化學(xué)性質(zhì)極為活潑，易于失去電子(氧化)或獲得電子(還原)，特別是氧化作用強，故具有強烈的引發(fā)脂質(zhì)過氧化的作用。在體外，產(chǎn)生自由基的方式有很多種，比如加熱、紫外光照射、電磁輻射、氧化還原反應(yīng)等，一旦生物體內(nèi)生成過多的自由基，而機體本身對自由基的防御能力不足時，就可引起生理變化。自由基包括超氧陰離子自由基、羥自由基、脂氧自由基、一氧化氮自由基等，活性氧自由基對生物機體可產(chǎn)生一系列的損傷，例如攻擊多聚不飽和脂肪酸，引起細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，從而改變生物膜結(jié)構(gòu)和功能;通過破壞蛋白質(zhì)的巰基和氨基的結(jié)構(gòu)，可引起蛋白質(zhì)變性、交聯(lián)，喪失酶的活性，而損傷DNA還可導(dǎo)致基因突變。因此，生物體內(nèi)活性氧的生成與清除的平衡對生物體新陳代謝是相當(dāng)重要的。

2 生物體對自由基的防御—抗氧化酶系

為了防止自由基對生物體的損害作用，在需氧生物體內(nèi)進化了一種有效的防御機制［1］，一是酶促反應(yīng)，即具有特異性的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等;另一種是非酶促反應(yīng)，主要是一些具有抗氧化作用的抗氧化劑，包括維生素E、維生素C、谷胱甘肽、類胡蘿卜素、膽紅素等。

抗氧化酶系［2］主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)等。超氧化物歧化酶(SOD)［3］是廣泛存在于動物、植物和微生物中的具有核基因編碼的一類含有金屬元素的氧化還原酶類。SOD是目前發(fā)現(xiàn)的唯一以超氧陰離子自由基(O2－)為底物的酶，可催化O2－轉(zhuǎn)化為H2O2和O2，從而清除O2－，在維持生物機體內(nèi)的自由基產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中起著極其重要的作用。SOD按其分子所含金屬輔基的不同可以分為3類:Cu，Zn-SOD分布于哺乳動物紅細(xì)胞和胞液中;Mn-SOD存在于線粒體中;Fe-SOD主要見于細(xì)菌中。作為免除自由基損傷的重要抗氧化酶，SOD在生物的新陳代謝中起著不可忽視的作用，如神經(jīng)存活［4］以及信號傳遞［5］等，除此之外，超氧化物歧化酶的活性還與生物的免疫水平密切相關(guān)，對于增強吞噬細(xì)胞的防御能力和整個機體的免疫功能有重要作用［6］。生物體內(nèi)生成的SOD不是恒定不變的，受環(huán)境影響，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS增加時，誘導(dǎo)SOD合成，避免由于氧代謝產(chǎn)生的過多自由基引起的氧化損傷。

過氧化氫酶(CAT)［7］是一類廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)的末端氧化酶，其功能是催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫分解成水和氧分子，使得H2O2不至于與O2－鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的－OH，防止膜脂過氧化。CAT活性的變化在一定程度上能反應(yīng)出機體在脅迫環(huán)境下的免疫力［8］，因此可以測定CAT的活性變化來檢測環(huán)境脅迫對生物的影響。

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)是生物體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。硒是GSH-Px酶系的重要組成成分，它可以催化GSH反應(yīng)生成GSSG的同時，促進了H2O2的分解，將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，進而保護細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能損傷，是反應(yīng)機體抗氧化能力的重要指標(biāo)之一。GPX在過氧化氫酶含量很少或是機體產(chǎn)生H2O2很低的組織中還可以替代CAT清除H2O2［9］，不僅能夠清除脂類氫過氧化物，還可廣泛的清除有機氫過氧化物［10］，具有防止畸變、預(yù)防衰老等重要生理作用。GPX活性的變化可以間接反應(yīng)生物體在環(huán)境的改變下體內(nèi)的抗氧化狀態(tài)，能夠作為機體受到脅迫的生物標(biāo)志物。

3 脂質(zhì)過氧化物—丙二醛(MDA)

機體通過酶系統(tǒng)與非酶系統(tǒng)產(chǎn)生的氧自由基，能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物。如:醛基(丙二醛MDA)、酮基、羥基、氫過氧基以及新的氧自由基等。脂質(zhì)過氧化作用不僅把活性氧轉(zhuǎn)化成活性化學(xué)劑，即非自由基性的脂類分解物，而且還通過鏈?zhǔn)椒磻?yīng)將活性氧的作用放大。因此，初始的一個活性氧能導(dǎo)致很多脂質(zhì)過氧化物的生成，其中一些是無害的，另一些則能夠引起細(xì)胞代謝功能減弱，甚至導(dǎo)致生物體死亡。MDA作為不飽和脂肪酸過氧化終產(chǎn)物之一，能與蛋白質(zhì)的－SH和－NH2作用，既可以產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子內(nèi)交聯(lián)也可產(chǎn)生分子間交聯(lián)，是依賴－SH或－NH2維持活性的酶失活，使激素受體損傷，因此被當(dāng)作是一種細(xì)胞膜氧化損傷的指示物［11］。測試MDA的量常?？梢苑从硻C體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接的反映出細(xì)胞損傷的程度。

MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，正常生理狀態(tài)下，機體內(nèi)MDA的含量是極低的［12］，其含量的高低又間接反映了機體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，通過SOD與MDA的結(jié)果分析有助于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、藥理及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。

4 抗氧化酶之間的作用

SOD、CAT 和 GSH-Px之間具有協(xié)同作用［13］(圖1)，生理條件下組織和細(xì)胞中存在一定ROS，SOD中的Cu2+可被H2O2還原從而失去活性，CAT 和GSH-Px可消除H2O2，對SOD有一定的保護作用;O2－也可以使 CAT和 GSH-Px失活，而SOD又能夠保護這2種酶，因此這3種酶組成了生物體內(nèi)相互保護的防御系統(tǒng)。SOD、CAT和GSH-Px一起可以減輕并阻止脂質(zhì)過氧化的一級觸發(fā)作用，還可通過還原氫過氧化物來減輕阻止二級觸發(fā)反應(yīng)，三者組成機體防御自由基的體系是互為補充，相輔相成［14］，3種酶的聯(lián)合效應(yīng)，能夠更有效的清除生物體內(nèi)的活性氧自由基，保護機體不受損害。

圖1 SOD、CAT和GSH-Px在細(xì)胞中的分布及相互作用示意圖［13］Fig.1 The distribution and interaction of SOD、CAT and GSH-Px［13］

5 環(huán)境因素對水生生物體內(nèi)抗氧化酶活性的影響

5.1 溫度

溫度是影響水生生物存活最重要的環(huán)境因子之一，不僅對其生長和繁殖起決定性的作用，而且對生物機體的代謝有較為明顯的影響。溫度是生物體內(nèi)酶活變化的函數(shù)，即在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，酶催化反應(yīng)的速度加快并在某一溫度下，酶活力達(dá)到最大值;超過一定的反應(yīng)溫度，酶催化反應(yīng)速度反而隨著溫度的升高而減慢。溫度的急劇變化能直接影響水生生物體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)［15］，主要是因為溫度改變，能夠?qū)е聶C體耗氧量增加［11］，從而促進ROS的產(chǎn)生以及細(xì)胞的氧化狀態(tài)，引起相關(guān)抗氧化劑和氧化酶體系的一系列反應(yīng)［16-17］。宋林生等［18］研究了中華絨螯蟹在溫度驟升9 h后抗氧化酶活力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝胰腺中CAT和SOD活性在溫度升高后馬上出現(xiàn)顯著降低，在6 h后開始趨于穩(wěn)定;MDA的含量在升溫后隨時間的延長逐步增加。Chen等［19］研究表明，在溫度突變后，櫛孔扇貝的血細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞內(nèi)的ROS、ACP和SOD等免疫指標(biāo)均發(fā)生顯著變化。李大鵬等［20］發(fā)現(xiàn)水溫對中華鱘體內(nèi)自由基水平及其抗氧化防御體系有著顯著的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)菌［21］、原生動物及枝角類［22］等微型生物中，其體內(nèi)抗氧化酶活性在低溫脅迫或是高溫脅迫下，都有顯著提高，以此來抵御活性氧對機體的損傷。由此說明，溫度的驟然改變會影響機體的生理功能和免疫防御能力，會導(dǎo)致自由基代謝的紊亂，從而影響機體的新陳代謝。

5.2 鹽度

作為重要的環(huán)境因子之一，鹽度能夠直接影響水生生物的存活生長、滲透調(diào)節(jié)以及免疫能力。鹽度的變化能夠?qū)λ镌斐梢欢ǖ臐B透脅迫，引起應(yīng)激反應(yīng)［23］。在等滲環(huán)境下，機體不需要耗能來進行滲透壓調(diào)節(jié)，生物體表現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，而在鹽度變化后，機體處于非等滲環(huán)境，需要耗費大量能量來進行體內(nèi)水鹽代謝調(diào)節(jié)，一旦鹽度超過了生物體自我調(diào)節(jié)范圍，就會影響到其正常的生理代謝水平，從而導(dǎo)致疾病的爆發(fā)。國內(nèi)外學(xué)者的研究集中于鹽度對水生生物生長、存活、能量收支以及免疫生理變化的影響［24-30］。葉建生等［31］通過凡納濱對蝦在鹽度突變后體內(nèi)非特異性免疫因子的變化發(fā)現(xiàn)，鹽度突變后，體內(nèi)血細(xì)胞內(nèi)O2－產(chǎn)量呈先升后降的趨勢，酚氧化酶(PO)活力顯著升高而SOD活性顯著低于對照組。余燕等［32］探討了點帶石斑魚幼魚消化酶及抗應(yīng)激酶在低鹽度脅迫下的變化規(guī)律，結(jié)果表明SOD活力隨鹽度梯度下降呈上升趨勢，CAT和GSH-Px活力以及消化酶活力隨鹽度梯度下降呈降低趨勢，認(rèn)為低鹽度脅迫能導(dǎo)致魚體自由基代謝紊亂，應(yīng)激性增強，最終阻礙了幼魚健康生長。通過鹽度脅迫對鹽生隱桿藻抗氧化系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，隨著鹽度脅迫程度的增加，MDA含量和抗氧化酶(SOD、GR、APX、ASA、GSH)活性不斷增強［33］。包斯琴等［34］在研究外生菌根菌 Paxillus的抗鹽機理時發(fā)現(xiàn)，不同的菌株隨鹽度脅迫時間的變化，其體內(nèi)抗氧化酶活性的變化規(guī)律有所差異，但是鹽處理的菌株抗氧化酶活性明顯高于對照菌株。

5.3 pH

pH作為比較容易變化的水體生態(tài)環(huán)境因子，對水質(zhì)和水生生物有諸多影響。水體pH變化，不僅影響水中氮磷的轉(zhuǎn)化，還能影響水生生物存活生長、免疫和代謝［35］。pH對櫛孔扇貝免疫活性有明顯的刺激作用，且在一定范圍內(nèi)隨刺激強度的增加呈現(xiàn)免疫活性的正調(diào)節(jié);在高強度pH刺激下，扇貝免疫活性呈現(xiàn)出負(fù)調(diào)節(jié)［36］。有研究表明，pH的變化會影響蝦蟹從外界吸收氧的能力，進而影響其耗氧率［37］。極端的 pH環(huán)境使水生生物血液酸堿平衡紊亂，會導(dǎo)致離子調(diào)節(jié)機制、氣體交換以及血氧輸送等功能喪失，造成缺氧癥，嚴(yán)重者甚至危及生物體存活。一般而言，pH很少單獨對水中生物有直接危害作用，但在特定環(huán)境條件下，pH能夠和其他環(huán)境因子協(xié)同作用，間接地對水生生物產(chǎn)生影響［35］，在水生動物中，軟體動物最為敏感［38］。哈承旭［39］在研究高 pH 脅迫“黃海1號”中國對蝦時發(fā)現(xiàn)，“黃海1號”和野生群體在高pH條件下均表現(xiàn)出一定的應(yīng)激能力，溶菌酶(LSZ)、酚氧化酶(PO)以及SOD活力隨pH的升高而增強，在pH 9.4時，兩群體中國對蝦全部死亡。

5.4 氨氮

水體中的氨氮主要由生物排泄物、殘餌以及動植物尸體等含氮有機物經(jīng)微生物分解產(chǎn)生，大量的有毒物質(zhì)(氨氮、硫化氫以及亞硝酸氮等)會導(dǎo)致養(yǎng)殖生物缺氧或中毒死亡。目前，氨氮已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中常見的脅迫因子［40］。氨氮在天然水體中以離子銨(NH4+)和非離子氨(NH3)的形式存在，兩者在水體中可以相互轉(zhuǎn)化。其中非離子氨可以穿透細(xì)胞膜，進而對機體產(chǎn)生毒性效應(yīng)，而離子氨(NH4+)帶有電荷，有較強的水溶性，可以跟水結(jié)合成更大的水合離子，很難通過魚鰓細(xì)胞膜［41］。有關(guān)氨氮對水生生物產(chǎn)生的生理機制，比較復(fù)雜。目前，大多數(shù)人認(rèn)為NH4+升高，取代了K+，從而導(dǎo)致N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體谷氨酸鹽感受器過度活化，大量的Ca2+涌入，隨后中央神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞死亡［42］。也有人認(rèn)為氨氮能夠抑制血液載氧能力［40］，最終會因為體內(nèi)缺氧而導(dǎo)致機體代謝紊亂。曾媛媛等［43］認(rèn)為，氨氮脅迫顯著影響擬穴青蟹各組織器官的SOD和GPX活性，表現(xiàn)為隨著氨氮脅迫含量升高和脅迫時間延長，擬穴青蟹各組織器官中SOD和GPX活性下降。陳家長等［44］認(rèn)為，超過3 mg/L的氨氮質(zhì)量濃度脅迫能夠顯著降低羅非魚的免疫力，增加對海豚鏈球菌的易感性。由此可見，氨氮不僅能夠?qū)λ锏拿庖吡υ斐捎绊?，而且還能加強水生動物對病原菌的易感性。

5.5 污染物

隨著工業(yè)廢水的大量排放，重金屬污染已嚴(yán)重影響到水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，由于水體中過量重金屬的存在，嚴(yán)重威脅著水生生物的生長、繁殖及洄游等生物活動。目前，國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于重金屬對水生生物毒害作用的研究較為廣泛，涉及到微型藻類、水生植物、橈足類、枝角類、魚類、貝類等，而以其體內(nèi)抗氧化酶作為水體污染監(jiān)測指標(biāo)的研究已成為熱點。張紅霞等［45］通過重金屬離子對日本蟳血淋巴抗氧化酶的研究發(fā)現(xiàn)，在低濃度重金屬離子影響下，日本蟳血淋巴中SOD活力一直呈激活狀態(tài)。而高濃度組 SOD活力在短時間內(nèi)激活后受到抑制，4種重金屬離子對日本蟳血淋巴SOD、GPX活力的毒性大小為Hg2+＞Cd2+＞Cu2+＞Pb2+，認(rèn)為出現(xiàn)這種差別的原因是生物體對不同重金屬離子的需求有所差異而且不同重金屬離子對組織中抗氧化酶的致毒機理不同。研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬離子脅迫下，靈芝菌［46］、南極細(xì)菌［47］、酵母菌［48］和苜蓿中華根瘤菌［49］等微生物體內(nèi)的抗氧化酶活性均有不同程度的升高，以減少細(xì)胞受到的損傷。

苯酚類等持久性有機化合物有很強的毒性，是當(dāng)今環(huán)境中重要的污染物之一，極易在水體環(huán)境中不斷積累并通過食物鏈傳遞，嚴(yán)重威脅著生態(tài)環(huán)境以及人類的健康。彭金良等［50］研究了普通小球藻的生長、光合色素和MDA含量及抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性在 α-萘酚脅迫下的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著 α-萘酚濃度的升高，藻的SOD、CAT、POD活性均先升高后下降，MDA含量在3種抗氧化酶活性不同程度下降后才會急劇上升，膜受脂質(zhì)過氧化作用的損傷程度加劇。認(rèn)為普通小球藻的致毒機制之一是α-萘酚導(dǎo)致膜脂過氧化，而在污染物脅迫下，抗氧化酶具有防御保護細(xì)胞的作用。除此之外，海洋微藻還對于BDE-47有較高的敏感性，可產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，通過增強體內(nèi)SOD和CAT活性以減少藻細(xì)胞自身的危害［51］。

張辰佳等［52］研究了3種酚類對多刺裸腹溞GST和AChE活力的影響，發(fā)現(xiàn)短時間內(nèi)(24 h)低濃度酚類化合物對GST和AChE活力具有誘導(dǎo)作用，但隨著酚類化合物處理濃度的升高和處理時間的延長，酶活力受到顯著抑制。由此說明，環(huán)境中的有機污染物會對水生生物產(chǎn)生氧化脅迫，抗氧化防御系統(tǒng)可以作為生物標(biāo)志物來檢測海洋環(huán)境中有機污染物對水生生物的生化毒性。

綜上所述，自由基和ROS在生物體生理代謝過程中以及環(huán)境污染的毒害機制中發(fā)揮了重要作用，許多研究者對水生生物進行了廣泛的研究，將對水生生物抗氧化酶防御系統(tǒng)的影響作為生物標(biāo)志物應(yīng)用到環(huán)境的監(jiān)測中。從目前的研究看，關(guān)于生物體內(nèi)抗氧化酶的研究主要集中于對抗氧化酶活性以及相關(guān)基因表達(dá)及分子進化［53］、基因重組［54］的研究。其中枝角類、橈足類在環(huán)境脅迫后抗氧化酶活性的研究較少，對于其在免疫應(yīng)答中的具體作用機制的研究更是微乎其微。為了今后養(yǎng)殖生物活餌料的大規(guī)模發(fā)展，這些餌料生物對環(huán)境因子的響應(yīng)機制將會成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點。

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