骨髓干細胞分化的成骨樣細胞與可降解鎂合金體外相容性的研究

楊曉龍 李德華 李洪秀

隨著生活節(jié)奏的加快，各種原因導致的骨組織損傷、缺損患者越來越多。目前臨床治療骨損傷的骨板、骨釘及植骨材料主要是不銹鋼、鈦合金及聚乳酸等。但這些材料不能降解需要二次手術取出，并且組織相容性差［1］。因此尋找力學性能好、組織相容性強，又可安全降解的新型骨組織工程支架材料意義重大。

最新發(fā)現(xiàn)表明鎂合金具有良好的力學特性及人工可降解性，有望成為新型植骨材料，應用于骨損傷的固定及組織工程骨的支架材料［2］。但鎂合金與細胞的生物相容性尚待探討，其能否利于成骨細胞的生長增殖分化尚無定論。因此，本研究擬將骨髓干細胞誘導分化為成骨樣細胞，并在體外與鎂合金材料復合培養(yǎng)，檢測成骨樣細胞的形態(tài)、增殖能力及成骨分化情況，為鎂合金的體外細胞相容性提供實驗數(shù)據(jù)，為其能成為新型骨修復材料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級SD大鼠20只，體質量100～150 g，雌雄不限，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑 L-DMEM、H-DMEM、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉(Sigma)，堿性磷酸酶染色試劑盒、ALP活度檢測試劑盒(凱基生物)。

1.3 大鼠BMSCs的原代培養(yǎng)及向成骨樣細胞分化 大鼠行頸椎離斷法處死，無菌分離雙側股骨，含10%FBS的L-DMEM沖洗骨髓腔，接種至50 ml培養(yǎng)瓶中。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。每3 d換液，達80%融合時傳代培養(yǎng)。

取P3的BMSCs，以0.5×105/孔的細胞懸液接種于鋪有蓋玻片的六孔板。待細胞達90%融合時更換成骨誘導培養(yǎng)液(含10%FBS的H-DMEM、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉、10-7 mol/L地塞米松、5 mg/L抗壞血酸)。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d換液。

1.4 堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定誘導后的成骨樣細胞 當誘導后細胞達90%融合時，4%多聚甲醛固定，PBS漂洗。堿性磷酸酶染色(按試劑盒說明進行)，封片，光學顯微鏡觀察。

1.5 可降解鎂合金材料樣品的制備 將鎂合金(重量百分比:Zn 1.2%，Mn 0.6%，Ca 2.0%)支架材料用PBS清洗并吹干，置于24孔培養(yǎng)板，紫外線照射消毒正反面各2 h，備用。

1.6 成骨樣細胞與鎂合金材料的復合培養(yǎng) 消化制備2×105/ml的成骨樣細胞懸液，接種到置于24孔培養(yǎng)板中的鎂合金支架材料表面，孵箱內復合培養(yǎng)。24 h、48 h、72 h后行戊二醛固定，洗滌，脫水，CO2臨界點干燥、噴金后，掃描電子顯微鏡細胞形態(tài)。

1.7 制備鎂合金支架材料浸提液 無菌條件下，按照材料表面積/浸提介質為0.003 cm2/L的比例，加入成骨誘導培養(yǎng)液至盛有鎂合金支架材料的容器中。孵箱中孵育24 h后提取容器中的液體，即為浸提液，應用此浸提液進一步培養(yǎng)成骨樣細胞。

1.8 MTT法檢測浸提液培養(yǎng)的成骨樣細胞增殖活性 消化制備1×104/ml的成骨樣細胞懸液，接種至96孔板，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換為浸提液，對照組加入普通的成骨誘導培養(yǎng)液，分別培養(yǎng) 12 h、24 h、48 h、72 h 后，每孔加入 20 μl MTT(5 mg/ml)，37℃孵育 4 h，每孔加 DMSO 150 μl，震蕩，用酶聯(lián)免疫儀選擇570nm波長測定各孔的光吸收值。

1.9 檢測浸提液培養(yǎng)的成骨樣細胞ALP活度 消化制備1×105/ml的成骨樣細胞懸液，接種至6孔板，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換為浸提液，對照組加入普通的成骨誘導培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h、72 h后，胰酶消化制成單細胞懸液，超聲粉碎細胞，按ALP活度檢測試劑盒說明書進行堿性磷酸酶活度的檢測。

1.10 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差表示，用SPSS 13.0軟件，采用One-way ANOVA進行數(shù)據(jù)分析。P＜0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 骨髓干細胞分化為成骨樣細胞的形態(tài)觀察及鑒定 原代培養(yǎng)的骨髓干細胞逐漸伸展成長梭形，類似成纖維細胞，呈渦輪狀緊密排列(圖1)。加入成骨誘導培養(yǎng)液后，逐漸變成多角形，具有成骨細胞的形態(tài)特點，并聚集形成鈣化結節(jié)(圖2)。堿性磷酸酶染色顯示成骨誘導后的細胞含有大量ALP，呈深棕黑色陽性表達(圖3)。證實骨髓干細胞經(jīng)成骨誘導后可分化為成骨樣細胞，具有成骨細胞的形態(tài)和特性。

圖1 原代培養(yǎng)的骨髓干細胞(相差顯微鏡×100)

圖2 骨髓干細胞誘導分化的成骨樣細胞(相差顯微鏡×100)

圖3 成骨樣細胞的堿性磷酸酶染色(光鏡×100)

2.2 掃描電鏡觀察 成骨樣細胞黏附在較粗糙的材料表面，伸展成短梭形或多角形，并伸出突起，形成細胞連接，生長狀態(tài)良好，增殖旺盛(圖4)。表明支架材料具有明顯的細胞相容性，適合細胞黏附生長。

圖4 成骨樣細胞與支架材料復合培養(yǎng)(掃描電鏡×100)

2.3 MTT法檢測細胞增殖活性 結果顯示隨著培養(yǎng)時間的延長，兩組的吸光度都逐漸增高(P＜0.05)，表明浸提液與普通成骨誘導培養(yǎng)液均可保證成骨樣細胞正常生長，經(jīng)歷了潛伏期和對數(shù)生長期。而在相同時間點兩組的吸光度并未有明顯差異(P＞0.05)，表明浸提液培養(yǎng)的成骨樣細胞具有正常的增殖活性，并未受到抑制，浸提液沒有明顯的細胞毒性(圖5)。

圖5 成骨樣細胞的MTT值

2.4 ALP活度檢測 結果顯示隨著培養(yǎng)時間的延長，兩組的細胞的ALP活度都逐漸增高(P＜0.05)，表明浸提液與普通成骨誘導培養(yǎng)液一樣可以促進成骨樣細胞分泌堿性磷酸酶。而在相同時間點兩組的ALP活度并未有明顯差異(P＞0.05)，表明浸提液培養(yǎng)的成骨樣細胞可以維持其正常的成骨活性(圖6)。

圖6 成骨樣細胞的ALP活度值

3 討論

Friedenstein等［3］發(fā)現(xiàn)骨髓干細胞在一定條件下可分化為成骨細胞，表達成骨細胞表型，骨髓干細胞成功活躍在骨組織工程領域。本研究采用全血培養(yǎng)法分離SD大鼠股骨骨髓，培養(yǎng)的骨髓干細胞呈長梭形，增殖能力強，具有間充質干細胞的特性。在成骨誘導液培養(yǎng)下骨髓干細胞變?yōu)槎嘟切尾⑿纬赦}結節(jié)，經(jīng)堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)誘導后的細胞呈深棕色陽性表達，我們認為其具有成骨細胞的形態(tài)及生物學特性，可以稱為成骨樣細胞，符合成骨細胞分泌有機成分和礦物質的鑒定指標［4］。

支架材料是組織工程領域的三大要素之一，必須具備良好的組織相容性和可降解性，促進細胞的黏附和生長。作為骨組織工程的支架材料還要富于一定的韌性和硬度，因此近年來鎂合金作為可降解的新型骨組織工程支架材料備受關注［5］。其具有高分子化合物獨特的可降解性，又兼有金屬材料的堅韌性。數(shù)據(jù)表明高強度鎂合金的比強度可以達到480 gPa/(g/cm3)，密度約為1.7 g/cm3，與人的骨密度(1.75 g/cm3)較接近，符合理想的骨板要求;鎂合金的彈性模量是45 gPa，而人骨彈性模量為 20 gPa，足以滿足人植骨的要求［6］。大量研究又表明作為骨固定材料鎂合金可以加速損傷骨質愈合，抑制局部骨質疏松的發(fā)生［7，8］。

目前對于支架材料的評價包括體內和體外兩種。體外實驗是將細胞或組織與支架材料或支架浸提液復合培養(yǎng)，檢測細胞生長、增殖及功能等相關指標，比體內實驗更具有可控性、可重復性、可定量分析等優(yōu)點［9］，是評價支架材料組織相容性的重要依據(jù)。因此本研究將誘導成功后的成骨樣細胞與鎂合金復合培養(yǎng)，經(jīng)掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)材料表面有大量細胞附著，生長狀態(tài)良好，表明此支架材料有利于成骨樣細胞的黏附生長。檢測浸提液培養(yǎng)下細胞的增殖活性，有助于考察支架材料的毒性［10］。MTT法操作簡單、靈敏度高、重復性好是檢測細胞增殖活性的主要方法。本實驗結果表明經(jīng)浸提液培養(yǎng)的成骨樣細胞仍具有旺盛的增殖潛能，說明鎂合金支架材料不具有細胞毒性。本實驗又應用ALP活度檢測試劑盒檢測浸提液培養(yǎng)細胞的成骨分化情況，發(fā)現(xiàn)浸提液培養(yǎng)的細胞與正常培養(yǎng)液組的堿性磷酸酶活度并未出現(xiàn)明顯差異，說明鎂合金材料的浸提液與正常成骨誘導液一樣，也可以促進成骨樣細胞的成骨分化，具有明顯的骨誘導能力。

本實驗探討了鎂合金材料在體外促進成骨樣細胞的增殖和分化情況，但關于鎂合金植骨材料在動物體內組織中能否促進骨組織再生，有待于后續(xù)的體內實驗進行證實。

［1］Liu Zhendong，F(xiàn)an Qingyu.Stress shield effect-search the lost key.Chinese Journal of Orthopaedic Trauma，2002，4(1):62.

［2］Li LC，Gao JC.Evaluation of cyto-toxicity and corrosion behavior of alkali-heat treated magnesium in simulated body fluid.Surf Coat Techn，2004，185(1):92.

［3］Shih CH，Nien J C，Shie LH，et al.Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow.Stem cells，2002，20(1):249-258.

［4］Pan Feng;BAI Shu-ling.Experimental Study on the Differentiation of Cultured Bone Marrow Stromal Stem Cells(BMSCs)of Rabbit into the Osteoblast in Vitro.Progress of Anatomical Sciences，2005，11(1):12-15.

［5］Simion M，F(xiàn)ontana F.Autogenous and xenogeneic bone grafts for the bone regeneration.Minerva Stomatol，2004，53:191-206.

［6］Mark P Staiger， Alexis M Pietak， J erawala Huadmai，et al.Magnesium and its alloys as orthopedic biomaterials:a review.Biomaterial，2006，27(9):1013.

［7］Saris NE，Mervaala E，Karppanen H，et al.Magnesium:an update on physiological，clinical and analytical aspects.Clin Chim Acta，2000，294(1-2):1-26.

［8］Dai Kerong.Fracture fixation and stress shield effect.Journal of Medical Biomechanics，2001，15(2):69.

［9］Witte F，Kaese V，Haferkamp H，et al.In vivo corrosion of four magnesium alloys and the associated bone response.Biomaterials，2005，26(17):3557-3563.

［10］Sun J，Li J，Liu X，et al.Proliferation and gene expression of osteoblasts cultured in DMEM containing the ionic products of dicalcium silicate coating.Biomed Pharmacother，2009，63(9):650-657.