Foxn1在小鼠胸腺增齡性萎縮中的作用

王長(zhǎng)山 李 麗 金紹靜 朱金玲 張玉萍 朱喜科 (佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

胸腺微環(huán)境是一個(gè)高度異質(zhì)性的三維網(wǎng)絡(luò)，主要構(gòu)成有骨髓淋巴造血祖細(xì)胞起源的胸腺細(xì)胞和非骨髓淋巴造血祖細(xì)胞起源的胸腺上皮細(xì)胞(TECs)，為胸腺細(xì)胞的發(fā)育提供了獨(dú)特的微環(huán)境。而哺乳動(dòng)物在青春期后胸腺的重量與年齡增長(zhǎng)呈負(fù)相關(guān)〔1〕，即胸腺隨著年齡增長(zhǎng)發(fā)生明顯萎縮，這種現(xiàn)象稱為胸腺增齡性萎縮。Foxn1是翼狀螺旋/叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員，在皮膚和TECs表達(dá)，在胸腺器官發(fā)生中促進(jìn)TECs表達(dá)并調(diào)控TECs分化和增殖。Foxn1基因缺失導(dǎo)致了嚴(yán)重的胸腺發(fā)育不全和免疫缺陷〔2〕。本項(xiàng)目以不同年齡階段的C57BL/6小鼠為研究對(duì)象，探討Foxn1的表達(dá)在胸腺增齡性萎縮調(diào)控中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)C57BL/6小鼠，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和四川成都達(dá)碩生物科技有限公司。許可證號(hào)分別為:SCXK-(軍)2007-004;SCXK-(川)2008-24。按年齡隨機(jī)分為青齡組(1月齡)、中青齡組(4月齡和6月齡)、中齡組(12月齡)和老齡組(18月齡)。每月齡組中雌雄各6只。

1.2 主要儀器與試劑 ABI 7500熒光定量PCR儀;VILBER凝膠成像儀;YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺(tái);DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀。Trizol Reagent/總RNA提取液(Invitrogen公司);Trizol總RNA提取液、PrimeScriptTM RT Reagent Kit、SYBRR Premix Ex TaqTM試劑盒、Real time quantitive PCR引物(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 胸腺指數(shù)及胸腺細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè) C57BL/6小鼠稱重，無菌條件下麻醉，剖開胸腔，摘取胸腺稱量，按公式計(jì)算胸腺指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/〔體重(g)×10〕。

剪切胸腺小葉至小碎片，37℃在含有0.125%膠原酶D(roche diagnostics)、0.1%DNase I(roche diagnostics)混合物的1640培養(yǎng)基中處理10 min，振蕩2～3次，重復(fù)此步驟2～3次至組織溶解。收集細(xì)胞，200目篩網(wǎng)(75 μm)濾過后1 500 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μl PBS混勻用于細(xì)胞計(jì)數(shù)。在冷PBS中撕破胸腺被膜并振蕩數(shù)次去除胸腺內(nèi)的淋巴細(xì)胞。然后放入DMEM培養(yǎng)基中在4℃繼續(xù)攪拌1 h。進(jìn)一步用含有5 U/ml DNase I的1 mg/ml膠原酶Ⅳ(roche，indianapolis，IN，USA)DMEM 溶液在 37℃消化 10 min，振蕩 2～3次。此步驟可以重復(fù)1～2次直到所有組織被溶解。溶解的細(xì)胞，用鼠抗CD45抗體染色，再和結(jié)合有抗鼠IgG的免疫磁珠(militenyi biotec)反應(yīng)，所獲得的細(xì)胞過LS磁柱收集，通過磁柱的細(xì)胞為胸腺上皮細(xì)胞。

1.3.2 Real-time RT-PCR擴(kuò)增TECs內(nèi)Foxn1 胸腺基質(zhì)細(xì)胞總RNA提取:向收集的106～107胸腺基質(zhì)細(xì)胞的Eppendorf管中加入1 ml Trizol，裂解 5 min。Eppendorf管中加入 200 μl氯仿，用力振蕩，室溫靜置5 min。10 000 r/min 4℃離心15 min，棄上清，移至新的Eppendorf管內(nèi)，加入等體積異丙醇，充分混勻，室溫靜置10 min。10 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，加入70%DEPC處理水配制乙醇1 ml，輕輕洗滌管壁。10 000 r/min 4℃離心10 min，棄乙醇，室溫真空干燥5 min。加入RNase-free水(DEPC 處理水)30～50 μl，溶解沉淀。取1 μl總 RNA 用紫外分光光度計(jì)測(cè)260 nm及280 nm的吸光度值，檢測(cè)提取RNA的重量及產(chǎn)量。總RNA－80℃保存?zhèn)溆?。取OD260/OD280在1.8～2.0之間的RNA用于實(shí)驗(yàn)。

Real-time PCR反應(yīng):采用SYBR Green I熒光染料嵌合法，分別擴(kuò)增目的基因(Foxn1 mRNA)和管家基因(GAPDH)，引物序列如表1所示。在同一次反應(yīng)中，設(shè)置樣品Foxn1片段PCR組、樣品GAPDH片段PCR組、陰性對(duì)照組，每組設(shè)2個(gè)平行重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)定閾值，軟件輸出Ct值;采用比較Ct值方法進(jìn)行定量，公式為:2－ΔΔCt，其中 ΔΔCt=(Ct目的基因 －Ct管家基因)實(shí)驗(yàn)組÷(Ct目的基因－Ct管家基因)對(duì)照組。

表1 Foxn1和GAPDH引物設(shè)計(jì)

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 C57BL/6小鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)結(jié)果隨著月齡增加，胸腺組織體積表現(xiàn)為明顯的逐漸減小趨勢(shì)，顏色也由乳白變黃白、表面光澤度下降 (圖1)。C57BL/6小鼠胸腺重量、胸腺指數(shù)和細(xì)胞數(shù)見表2。

表2 C57BL/6小鼠胸腺重量、胸腺指數(shù)及胸腺細(xì)胞數(shù)比較(± s，n=6)

表2 C57BL/6小鼠胸腺重量、胸腺指數(shù)及胸腺細(xì)胞數(shù)比較(± s，n=6)

與4月齡組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與12月齡比較:3)P＜0.01

組別 胸腺重量(mg)胸腺指數(shù)(mg/10 g體重)胸腺細(xì)胞數(shù)(×106)4月齡48.12±3.76 0.191±0.012 59.68±13.55 12月齡 30.48±6.601) 0.097±0.0231) 45.95±7.671)18月齡 7.15±2.412)3) 0.023±0.0082)3) 13.64±4.322)3)

4月齡較12月齡胸腺重量顯著減少(P＜0.05)，而12月齡又顯著低于18月齡(P＜0.01);4月齡與12月齡胸腺指數(shù)差異顯著(P＜0.05)，12月齡顯著低于18月齡(P＜0.01)。胸腺細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，4月齡較12月齡顯著減少(P＜0.05)，12月齡顯著少于18月齡(P＜0.01)。

2.2 C57BL/6小鼠胸腺基質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因Foxn1表達(dá)變化Real-time PCR檢測(cè)小鼠胸腺基質(zhì)發(fā)育相關(guān)基因Foxn1表達(dá)，基因在其特異的熔解溫度有特異性熔解峰。結(jié)果表明，隨著年齡的增長(zhǎng)Foxn1基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯減少，1月齡(0.909±0.119)，6月齡(0.689±0.108)，12月齡(0.240±0.063)，18月齡(0.047±0.010)(P＜0.05)。

圖1 C57BL/6小鼠胸腺組織體積增齡性變化

3 討論

胸腺是哺乳動(dòng)物中樞免疫器官，分泌多種胸腺激素等物質(zhì)，促進(jìn)T細(xì)胞分化、發(fā)育。胸腺自身沒有內(nèi)源性自我更新的干細(xì)胞，需要定期從骨髓招募〔3，4〕。來源于骨髓的淋巴造血祖細(xì)胞(LPCs)在胸腺與TECs相互作用發(fā)育為幼稚T細(xì)胞，再接受陽性、陰性選擇，最終分化為成熟T細(xì)胞〔5，6〕。胸腺中完全發(fā)育的TECs組織包括皮質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞(cTECs)與髓質(zhì)胸腺上皮細(xì)胞(mTECs)。這些區(qū)域?yàn)檫w移的LPC在胸腺的發(fā)育為成熟的T細(xì)胞提供了一個(gè)獨(dú)特的內(nèi)環(huán)境——胸腺微環(huán)境〔7，8〕。胸腺增齡性萎縮與胸腺微環(huán)境密切相關(guān)。胸腺增齡性萎縮減少了T淋巴細(xì)胞增殖和輸出，從而導(dǎo)致幼稚T細(xì)胞庫用盡和T細(xì)胞受體組分的收縮〔9〕。老齡胸腺中胸腺細(xì)胞已發(fā)生明顯退行性改變和凋亡。這樣就不可避免地減少對(duì)外來抗原的應(yīng)答性，導(dǎo)致病原體清除延遲，增加了老年人罹患癌癥、自身免疫性疾病以及病毒、細(xì)菌等病原感染的危險(xiǎn)〔10，11〕。

Foxn1是forkhead box(Fox)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，F(xiàn)ox轉(zhuǎn)錄因子家族是一組翼狀螺旋/叉頭型轉(zhuǎn)錄因子家族，包含一個(gè)特有的forkhead DNA結(jié)合域。在人類發(fā)現(xiàn)有20多種forkhead基因，其在內(nèi)胚層發(fā)育及內(nèi)胚層來源的器官形成中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用。Foxn1基因位于小鼠第11號(hào)染色體，人類第17號(hào)染色體，由9個(gè)外顯子(exons)構(gòu)成，其中exon 1為非編碼區(qū)，包括exon 1a和exon 1b。實(shí)驗(yàn)證明這兩個(gè)外顯子的上游序列存在組織特異性的啟動(dòng)子:exon 1a前的啟動(dòng)子在胸腺和皮膚中均有活化，而exon 1b前的啟動(dòng)子則只在皮膚中活化〔12〕。Foxn1是一個(gè)保守的轉(zhuǎn)錄因子，在人類和小鼠中均有648個(gè)氨基酸，其中85%的序列相同。

Foxn1是TECs發(fā)育中的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于cTECs和mTECs的產(chǎn)生都是必須的，F(xiàn)oxn1在胸腺器官發(fā)生中促進(jìn)TEC表達(dá)并調(diào)控 TEC 分化和增殖〔13，14〕，據(jù)報(bào)道，F(xiàn)oxn1－/－裸鼠，TECs 的發(fā)育受阻〔15〕。Foxn1－/－小鼠胸腺器官初期發(fā)育階段正常，其原基能形成，但淋巴造血干細(xì)胞不能遷入原基內(nèi)。另外，Mori等〔16〕近來研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxn1是小鼠胚胎胸腺內(nèi)血管化所必需的。實(shí)驗(yàn)表明，小鼠出生一周后，降低Foxn1的表達(dá)，會(huì)造成胸腺結(jié)構(gòu)破壞和退化，皮髓質(zhì)交界處嚴(yán)重?fù)p傷，TECs和T細(xì)胞產(chǎn)出減少等一系列生物功能影響，且這種影響是依賴于Foxn1劑量的，該依賴性對(duì)于高表達(dá)Foxn1的MHCⅡhiUEA-1himTECs尤為敏感〔17〕。Soza-Ried 等〔18〕構(gòu)造了一種 loxP-fl oxed-Foxn1(fx)小鼠，其Foxn1表現(xiàn)為表達(dá)量逐漸減少直至消失，3～6個(gè)月fx小鼠胸腺開始萎縮，其胸腺形態(tài)大小類似于野生老齡小鼠(18～22個(gè)月)，在為野生老齡小鼠胸腺提供外源性Foxn1的cDNA，結(jié)果有效緩解了胸腺萎縮和外周 CD4+細(xì)胞功能的減退。

筆者對(duì)增齡C57BL/6小鼠胸腺重量、胸腺細(xì)胞數(shù)與Foxn1表達(dá)量的關(guān)系研究結(jié)果表明Foxn1不僅對(duì)胚胎期的胸腺發(fā)育起重要作用，而且對(duì)出生后的胸腺維持及衰老時(shí)的萎縮具有顯著影響。胸腺TECs提供T細(xì)胞發(fā)育成熟所必需的微環(huán)境，TECs內(nèi)不同基因在特定時(shí)間和空間上的表達(dá)，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。這些復(fù)雜的事件和嚴(yán)格的調(diào)控決定了胸腺的生理功能。轉(zhuǎn)錄因子與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相互作用中多數(shù)涉及Foxn1，轉(zhuǎn)錄因子Foxn1在胸腺TECs發(fā)育分化中起重要作用。Foxn1表達(dá)隨著年齡的增長(zhǎng)呈顯著減少，可通過影響TECs分化和增殖，造成胸腺微環(huán)境惡化引起胸腺萎縮。

綜上所述，F(xiàn)oxn1參與了胸腺的形成、發(fā)育、成熟和退化萎縮各個(gè)階段，其表達(dá)水平在TECs不同的發(fā)育時(shí)期呈現(xiàn)不同的特點(diǎn)。對(duì)Foxn1的分子機(jī)制研究有利于闡明胸腺維持和退化萎縮機(jī)制，進(jìn)一步為延緩胸腺增齡性萎縮和促進(jìn)胸腺組織再生打下基礎(chǔ)。TECs分化、發(fā)育和凋亡涉及諸多信號(hào)通路的時(shí)序調(diào)控，如Wnt和BMP通路可能對(duì)TECs的Foxn1表達(dá)發(fā)揮重要調(diào)控作用。但是，目前對(duì)于Foxn1的上游信號(hào)通路和下游靶基因的理解仍很淺，有待深入研究。

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