羅格列酮減輕腎大部切除大鼠心肌單核細(xì)胞趨化蛋白1、轉(zhuǎn)化生長因子β1的表達(dá)

陳 怡 萬建新 吳可貴 許昌聲 (福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，福建 福州 350005)

目前慢性腎臟病(CKD)最主要的并發(fā)癥也是最重要的死亡原因就是心血管疾病，是CKD治療中艱巨的難題〔1〕。過氧化脂質(zhì)體增殖激活受體(PPARs)及其配體能提高組織對胰島素的敏感性，用于治療糖尿病腎病(DN)，并且能降低血壓、調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化、抗炎癥等〔2〕。另外，PPARs及其配體還具有更為廣泛的心血管保護(hù)作用，通過改善胰島素抵抗、糾正脂質(zhì)代謝紊亂、逆轉(zhuǎn)心肌肥厚、抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，從而改善心血管的病理性重構(gòu)，可能在代謝綜合征及其并發(fā)的心血管損害中發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用。羅格列酮是過氧化脂質(zhì)體增殖激活受體γ(PPAR-γ)激動(dòng)劑，在臨床上已用于治療糖尿病，但最近Nissen等〔3〕發(fā)表了一項(xiàng)有關(guān)羅格列酮的最新薈萃分析結(jié)果，表明羅格列酮可顯著增加患者心肌梗死危險(xiǎn)，結(jié)果提示羅格列酮有不利的獲益風(fēng)險(xiǎn)比，羅格列酮的安全性問題凸顯出來，但目前尚無定論。而我們前期的研究表明羅格列酮可改善慢性腎衰竭大鼠左心室肥厚〔4〕，本研究目的在于觀察不同劑量的羅格列酮對腎大部切除大鼠心肌單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)表達(dá)的影響，研究羅格列酮對慢性腎衰竭大鼠心臟保護(hù)作用的機(jī)制，為羅格列酮對CKD患者心血管并發(fā)癥的防治提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 羅格列酮(文迪雅)由葛蘭素史克公司生產(chǎn)。由北京中山生物試劑公司購買免疫組化試劑盒及各抗體。由北京北方生物技術(shù)研究所購買放射免疫檢測試劑盒。由Fermentas公司購買逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，由TaKaRa生物工程有限公司購買Premix Taq酶。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性SD大鼠32只(購買自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體質(zhì)量(220±20)g。分為兩大組，假手術(shù)組(n=8)和腎大部切除組(n=24)。手術(shù)后3 d再將存活的腎大部切除手術(shù)組大鼠24只隨機(jī)分成3組，腎大部切除組(NX組);腎大部切除加小劑量羅格列酮治療組(XL組);腎大部切除加三倍劑量羅格列酮治療組(DL組)，每組8只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 給藥 XL組予羅格列酮5 mg·kg－1·d－1灌胃;DL組，予羅格列酮15 mg·kg－1·d－1灌胃。假手術(shù)組和腎大部切除組每日予等量自來水灌胃。

1.3.2 慢性腎衰竭大鼠模型(腎大部切除大鼠)的建立 按照本課題組前期成功制模經(jīng)驗(yàn)建立動(dòng)物模型及假手術(shù)組〔4〕。

1.3.3 標(biāo)本處理 喂養(yǎng)8 w后以斷頭法處死動(dòng)物，開胸取心臟，沿房室環(huán)剪去心房及右心室游離壁，取部分左心室左冠狀面中部心肌組織放入10%中性甲醛液中固定保存用于制作石蠟切片，其余心肌組織放入－70℃液氮中保存。

1.3.4 放射免疫檢測 血清血管緊張素Ⅱ(A2)的檢測采用放射免疫方法。

1.3.5 心臟病理檢查 取心肌組織蠟塊切片后(4 μm)行HE染色，光鏡下觀察心肌的病理變化并攝片。

1.3.6 免疫組化 心肌組織MCP-1采用SP法免疫組化染色。一抗為山羊抗鼠MCP-1多克隆抗體，滴度為1∶100。按試劑盒說明書操作，以PBS代替一抗作空白對照。鏡下觀察細(xì)胞以胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為陽性信號(hào)。由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細(xì)胞圖像，利用病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，測定該區(qū)域面積的平均積分光密度值(OD值)，平均每張切片在高倍鏡下(×200)隨機(jī)選擇6個(gè)視野。

1.3.7 RT-PCR 按Trizol試劑說明提取心肌組織總RNA。以2 μg mRNA為模板，進(jìn)行 RT-PCR分析，反轉(zhuǎn)錄及 PCR方法，參見試劑盒說明。所用引物序列:TGF-β1上游引物為5'-CTTCAGCTCCACAGAGAAGAACTGC-3'，下游引物為 5'-CACGATCATGTTGGACAACTGCTCC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 298 bp。內(nèi)參照為GAPDH，其上游引物為5'-ACCACAGTCCATGCCATCACT-3';下游引物為:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物452 bp。PCR反應(yīng)體系總體積206 μl。TGF-β1 PCR反應(yīng)條件為 94℃變性5 min;94℃ 30 s，58℃45 s，72℃ 1 min，循環(huán)32 次;72℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳30 min，紫外燈下拍照，以White/Ultraviolet Transilluminator系統(tǒng)軟件分析圖像，目標(biāo)條帶與內(nèi)參照光密度的比為mRNA表達(dá)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 羅格列酮對大鼠血清A2的影響 術(shù)后8 w，與假手術(shù)組相比，各腎大部切除手術(shù)組大鼠血清A2水平均顯著升高(P＜0.01)。與腎大部切除組相比，各羅格列酮治療組血清A2水平降低均有顯著性差異(P＜0.01)。見表1。

2.2 心臟病理改變 術(shù)后8 w，HE染色顯示NX組心肌組織嚴(yán)重受損:肌纖維排列紊亂，大量心肌纖維斷裂，甚至出現(xiàn)肌原纖維溶解，心肌橫紋基本消失，廣泛的心肌細(xì)胞出現(xiàn)水腫和空泡變性，細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞間隙增大;假手術(shù)組心肌組織結(jié)構(gòu)較正常，肌纖維排列比較整齊有序，心肌橫紋清晰，細(xì)胞大小、形態(tài)正常，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，細(xì)胞核大小正常，細(xì)胞間隙正常，而DL組部分逆轉(zhuǎn)其病理損害。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌HE染色(×100)

2.3 心肌組織MCP-1的表達(dá) 術(shù)后8 w，假手術(shù)組心肌組織內(nèi)幾乎未見MCP-1表達(dá)，NX組在心肌細(xì)胞內(nèi)可見較多MCP-1表達(dá)(P＜0.01)。與NX組相比，各羅格列酮治療組心肌細(xì)胞內(nèi)MCP-1表達(dá)有所降低，以DL組的差異有顯著性(P＜0.01)。見表1、圖2。

圖2 各組大鼠心肌MCP-1表達(dá)(免疫組化，×200)

2.4 心肌組織TGF-β1 mRNA的表達(dá) 術(shù)后8 w，與假手術(shù)組相比，各腎大部切除手術(shù)組大鼠心肌組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。與腎大部切除組相比，各羅格列酮治療組心肌組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)有所降低，以腎大部切除加三倍劑量羅格列酮治療組的差異有顯著性 (P＜0.01)。見表1、圖 3。

表1 羅格列酮對大鼠血清A2、心肌MCP-1、TGF-β1 mRNA 的影響(±s，n=8)

表1 羅格列酮對大鼠血清A2、心肌MCP-1、TGF-β1 mRNA 的影響(±s，n=8)

與NX組比較:1)P＜0.01，2)P＜0.05;與XL組比較;3)P＜0.05

組別 A2(pg/ml) MCP-1 TGF-β1/GAPDH假手術(shù)組713.59±160.781) 0.006 3±0.002 31) 0.076±0.0231)NX組 2 022.21±487.69 0.139 4±0.016 4 0.311±0.127 XL組 1 189.62±215.222)0.081 3±0.010 11)2) 0.109±0.0342)DL組 854.05±215.221)0.061 7±0.013 81)3)0.063±0.0321)3)

3 討論

CKD患者是心血管疾病的高危人群，可導(dǎo)致心腦血管疾病的高發(fā)病率和高病死率。近年來的研究提示羅格列酮能抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖〔5〕。曲格列酮、吡格列酮、羅格列酮能抑制A2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積的增加以及骨骼肌肌動(dòng)蛋白、心鈉肽基因表達(dá)的上調(diào);也能抑制壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的兩種動(dòng)物模型的心臟體重比增加、室壁厚度增加及心肌細(xì)胞直徑增加〔6〕。但尚無有關(guān)羅格列酮對慢性腎臟病的心血管并發(fā)癥的研究。我們的前期研究表明:羅格列酮能改善慢性腎衰竭大鼠的高血壓，減少蛋白尿、降低血BUN、Scr，改善腎組織的病變，呈劑量依賴性的腎臟保護(hù)作用。同時(shí)羅格列酮可改善其左心室肥厚及抑制心肌組織膠原纖維沉積、減輕心肌組織纖維化，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)皮素、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)有關(guān)〔4〕。

心肌纖維化是指由于各種因素致心肌間質(zhì)膠原纖維結(jié)構(gòu)和含量的改變，使心肌僵硬度增加、導(dǎo)致心室收縮和舒張功能改變、冠狀動(dòng)脈硬化，最終導(dǎo)致高血壓、心肌梗死、心力衰竭、心律失常、心源性猝死等多種心血管疾病，因此，防止甚至進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)心肌纖維化已成為目前心血管疾病防治的重要課題〔7〕。在心肌纖維化的發(fā)展過程中，細(xì)胞因子是重要的參與因素，TGF-β和結(jié)締組織生長因子(CTGF)等均參與心肌細(xì)胞膠原代謝，是最后導(dǎo)致心肌纖維化的一種中介物〔8〕。TGF-β在心室重構(gòu)包括心肌細(xì)胞肥大、成纖維細(xì)胞增生及遷移、膠原網(wǎng)架改建中具有重要作用。在心臟心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中均有TGF-β表達(dá)。病理性增多的TGF-β可以誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生蛋白聚糖、纖維連接蛋白和各種膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，加速心肌纖維化。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β對心肌細(xì)胞的效應(yīng)完全類似于慢性左心室心肌纖維化、肥厚、衰竭、重構(gòu)的病理生理過程。同時(shí)，在心肌纖維化的發(fā)展過程中，A2的水平與TGF-β的表達(dá)高度相關(guān)，A2可激活Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，刺激TGF-β病理性增高，促進(jìn)纖連蛋白及I、Ⅲ型膠原的合成，導(dǎo)致心肌纖維化進(jìn)展〔9〕。已有報(bào)道，A2的多種生物學(xué)效應(yīng)與下調(diào) PPARs相關(guān)〔10〕。本研究推測羅格列酮對腎大部切除術(shù)大鼠心臟保護(hù)作用可能與下調(diào)A2，抑制大鼠心肌組織TGF-β1的表達(dá)有關(guān)。

MCP-1是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要因子，可促進(jìn)單核細(xì)胞的分化、聚集到炎癥部位、增加滲出，還能夠增加巨噬細(xì)胞超氧負(fù)離子的產(chǎn)生并誘發(fā)溶酶體酶的釋放，從而加重心肌缺血再灌注損傷。前壁心肌梗死小鼠(結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈)建模4 w后，心肌MCP-1 mRNA的表達(dá)增加;而在建模前3 d和建模后14 d，予變異的MCP-1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠以后，前壁心肌梗死小鼠的MCP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被阻斷，其4 w存活率明顯提高，左心室擴(kuò)張減輕、心肌纖維化改善、巨噬細(xì)胞聚集減少、心肌TNF-α的表達(dá)減輕。提示MCP-1表達(dá)的激活不利于心肌梗死后心室重構(gòu)的改善，可導(dǎo)致慢性心衰竭〔11〕。另外，體外實(shí)驗(yàn)提示，羅格列酮可呈濃度依賴的抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC-12)中由A2所誘導(dǎo)的MCP-1的表達(dá)〔12〕。本實(shí)驗(yàn)推測，羅格列酮下調(diào)A2，抑制大鼠心肌內(nèi)MCP-1的過度表達(dá)從而對腎大部切除大鼠心臟起到保護(hù)作用。

近年來，有關(guān)羅格列酮的心臟安全性問題爭論激烈，但尚無定論。長達(dá)5年的RECORD研究，納入了約4 500例糖尿病患者，結(jié)果顯示，與二甲雙胍或磺脲類相比，羅格列酮并不增加總體心血管住院或心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)，在心肌梗死、卒中或任何類型死亡的次要終點(diǎn)方面，兩組無顯著差異〔13〕。RECORD研究數(shù)據(jù)清楚地表明，羅格列酮與活性對照藥物具有相當(dāng)?shù)男难馨踩浴?型糖尿病旁路血管成形血運(yùn)重建研究(BARI 2D)的研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)論:在經(jīng)證實(shí)的冠狀動(dòng)脈疾病患者中，胰島素增敏劑羅格列酮與胰島素供給療法相比，并不增加主要的復(fù)合終點(diǎn)事件(死亡或主要心血管事件)〔14〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示梗死心肌重構(gòu)過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞間基質(zhì)纖連蛋白(FN)被降解;激活PPAR-γ可能通過抑制MMP-9的表達(dá)，減輕FN的降解，從而改善心肌重塑〔15〕。我們的研究也提示通過羅格列酮的干預(yù)，腎大部切除大鼠的左心室肥厚得到改善。我們既往的研究提示〔16，17〕，羅格列酮可保護(hù)腎功能、延緩腎臟病變進(jìn)展。我們推測，由于慢性腎衰竭的進(jìn)展得到延緩，腎大部切除大鼠左心室肥厚的進(jìn)展也得已延緩。同時(shí)，羅格列酮可降低慢性腎衰竭大鼠腎性高血壓，下調(diào)A2，抑制心肌組織MCP-1和TGF-β1的表達(dá)，改善心肌組織中膠原纖維的沉積、減輕心肌纖維化，改善其左心室病理性重構(gòu)，從而對慢性腎衰竭大鼠的心臟起到保護(hù)作用。

1 鄭法雷，章友康，陳香美，等.腎臟病臨床與進(jìn)展〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社，2005:278-87.

2 Guan Y.PPAR family and its relationship to renal complications of the metabolic syndrome〔J〕.J Am Soc Nephrol，2004;15(16):2801-15.

3 Nissen SE，Wolski K.Rosiglitazone revisited:an updated meta-analysis of risk for myocardial infarction and cardiovascular mortality〔J〕.Arch Intern Med，2010;170(14):1191-201.

4 陳 怡，萬建新，吳可貴，等.羅格列酮改善腎大部切除大鼠左心室肥厚〔J〕.中國動(dòng)脈硬化雜志，2011;19(12):989-94.

5 Mughal RS，Warburton P，O'Regan DJ，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma-independent effects of thiazolidinediones on human cardiac myofibroblast function〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2009;36(5-6):478-86.

6 Sakai S，Miyauchi T，Trukayama TY，et al.Peroxisome proliferator-activated receptor gamma activities inhibit endothelin-1 related cardiac hypertrophy in rats〔J〕.Clin Sci(London)，2002;103(s48):16-20.

7 Lammey ML，Baskin GB，Gigliotti AP，et al.Interstitial myocardial fibrosis in a captive chimpanzee(Pan troglodytes)population〔J〕.Comp Med，2008;58(4):389-94.

8 Pierce CW，Tucci MA，Lindley S，et al.Connective tissue growth factor(ctgf)expression in the tenosynovium of patients with carpal tunnel syndrome-biomed 2009〔J〕.Biomed Sci Instrum，2009;45(1):30-5.

9 黃 俊，覃國輝，馬業(yè)新，等.轉(zhuǎn)化生長因子-β1及其胞內(nèi)信號(hào)通路SMADs在大鼠心肌肥厚中的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2004;20(9):1601-4.

10 Kota BP，Huang TH，Roufogalis BD.An overview on biological mechanisms of PPARs〔J〕.Pharmacol Res，2005;51(2):85-94.

11 Hayashidani S，Tsutsui H，Shiomi T，et al.Anti-monocyte chemoattractant protein-1 gene therapy attenuates left ventricular remodeling and failure after experimental myocardial infarction〔J〕.Circulation，2003;108(17):2134-40.

12 李春暉，譚茗月，張新超.激活過氧化物酶增殖物激活受體對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中單核細(xì)胞趨化因子-1表達(dá)的影響〔J〕.中華老年醫(yī)學(xué)雜志，2006;25(9):664-7.

13 Home PD，Pocock SJ，Beck-Nielsen H，et al.Rosiglitazone evaluated for cardiovascular outcomes in oral agent combination therapy for type 2 diabetes(RECORD):a multicentre，randomised，open-label trial〔J〕.Lancet，2009;373(9681):2125-35.

14 The BARI 2D Study Group.A Randomized trial of therapies for type 2 diabetes and coronary artery disease〔J〕.NEJM，2009;360(24):2503-15.

15 楊大春，馬雙陶，楊永健，等.激活PPAR-γ對梗死心肌MMP-9及纖連蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2010;26(11):2130-5.

16 陳 怡，萬建新，吳可貴，等.羅格列酮減輕大鼠殘單核細(xì)胞趨化蛋白-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的表達(dá)〔J〕. 高血壓雜志，2008;16(3):243-8.

17 陳 怡，萬建新，吳可貴，等.羅格列酮對腎大部切除大鼠殘腎細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的影響及機(jī)制〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2008;5(5):385-8.