狂犬病毒MHC限制性CTL與Th表位的預(yù)測與鑒定①

胡曉波 朱乃碩

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子免疫實(shí)驗(yàn)室 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生物醫(yī)學(xué)研究院，上海200433)

狂犬病是一種由狂犬病毒引起的、危害極大的致命傳染病。中國是狂犬病嚴(yán)重流行的國家之一，每年因狂犬病而死亡的人數(shù)高達(dá)3000人左右，位居世界第二［1-3］。疫苗是當(dāng)前防治狂犬病的唯一途徑，然而現(xiàn)有的狂犬疫苗存在免疫程序復(fù)雜、細(xì)胞免疫反應(yīng)較弱等嚴(yán)重缺陷，無法保證在病毒潛伏期內(nèi)產(chǎn)生較高的保護(hù)力，不利于狂犬病的防治工作。有研究表明T細(xì)胞產(chǎn)生的CTL與Th免疫應(yīng)答反應(yīng)在抗狂犬病毒感染時(shí)發(fā)揮了重要作用［4-6］，因此篩選鑒定出相關(guān)的CTL與Th表位，并由此開發(fā)出具有高效預(yù)防或治療性作用的表位疫苗對(duì)防治狂犬病工作有重要的意義，但迄今為止，僅報(bào)道了少數(shù)幾個(gè)狂犬病毒的 CTL 與 Th 表位［4，7-9］。

隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測表位的方法和精確度有了很大的改善［10-12］。在狂犬病毒的四種蛋白中，糖蛋白(G蛋白)與核蛋白(N蛋白)是兩種誘導(dǎo)細(xì)胞免疫與體液免疫的重要蛋白，因此本研究采用生物信息學(xué)軟件 BIMAS［13］、RANKPEP［14］和 SYFPEITHI［11］對(duì) G 蛋白及 N 蛋白的CTL與Th表位進(jìn)行預(yù)測，并以淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、ELISPOT以及流式細(xì)胞法對(duì)獲得的表位進(jìn)行鑒定，初步獲得2條BALB/c小鼠MHC限制性CTL和Th表位，為下一步開發(fā)狂犬病毒的表位疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠24只，雌性，6～8周齡，25～30 g/只，購自中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1．2 實(shí)驗(yàn)材料 人用狂犬病疫苗(Vero細(xì)胞)購自遼寧成大生物股份有限公司(生產(chǎn)批號(hào):201106099)。ELISPOT試劑盒、小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。CCK-8試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。小鼠FITC-CD3、PE-CD4和PE/Cy5-CD8a熒光抗體購自美國Bio-Legend公司。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1．3 方法

1．3．1 狂犬病毒G蛋白與N蛋白的表位預(yù)測 狂犬病毒的 G蛋白(gi_32440976)與 N蛋白(gi_294999043)氨基酸序列檢索自NCBI數(shù)據(jù)庫。其中CTL表位采用BIMAS及SYFPEITHI軟件進(jìn)行預(yù)測，Th表位采用RANKPEP進(jìn)行預(yù)測，輸入G蛋白或N蛋白全長序列，選擇相應(yīng)MHC表型及參數(shù)，按結(jié)果得分的高低各選擇4條候選多肽用于鑒定實(shí)驗(yàn)。

1．3．2 多肽合成、溶解與分裝 多肽合成由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司完成，純度≥90%，共計(jì)8條。合成的多肽分別溶解于DMSO中，濃度為5 mg/ml，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3．3 小鼠分組與免疫 將BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組，即實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組12只。其中實(shí)驗(yàn)組腹腔注射0．5 ml人用狂犬病疫苗(Vero細(xì)胞)，對(duì)照組注射相同劑量的生理鹽水。各組小鼠均在第0天和第7天各免疫一次，注射部位與劑量均相同。

1．3．4 多肽刺激的淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 小鼠末次免疫后10天斷頭處死，無菌取脾后研磨過濾，用淋巴細(xì)胞分離液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml，加入96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μl/孔，同時(shí)加入稀釋好的多肽，終濃度為20 μg/ml，陽性對(duì)照孔加入終稀釋度為1∶10的狂犬病疫苗原液，空白對(duì)照孔為普通1640培養(yǎng)基。將淋巴細(xì)胞置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)。5天后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，于450 nm處測定吸光度A值，結(jié)果以3復(fù)孔的平均A450值表示。

1．3．5 ELISPOT法篩選可刺激分泌 IL-4和 IFN-γ的多肽 脾細(xì)胞分離后，調(diào)整細(xì)胞濃度為106個(gè)/ml，每只小鼠脾細(xì)胞樣品設(shè)4個(gè)復(fù)孔。其余步驟按照試劑盒說明操作:每孔加入100 μl細(xì)胞，陽性對(duì)照加入10 μl PHA，實(shí)驗(yàn)孔加入 10 μl終濃度為 20 μg/ml的合成多肽，空白對(duì)照孔為普通1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)20小時(shí)，棄去細(xì)胞樣品，洗滌后加入100 μl生物素標(biāo)記的抗體，孵育1小時(shí)后再次洗滌，加入100 μl酶標(biāo)親和素，孵育1小時(shí)。最后一次洗滌后加入100 μl顯色液于室溫下(25℃)顯色25分鐘，觀察斑點(diǎn)形成。顯色完畢后，用去離子水洗板3次終止反應(yīng)，將板放置于室溫避光陰涼處，干燥后用ELISPOT讀板機(jī)進(jìn)行讀板計(jì)數(shù)。

1．3．6 流式細(xì)胞法篩選可刺激T細(xì)胞反應(yīng)的多肽脾細(xì)胞分離后，調(diào)整細(xì)胞濃度為107個(gè)/ml，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μl/孔，同時(shí)加入稀釋好的多肽，終濃度為20 μg/ml。淋巴細(xì)胞培養(yǎng)5天后，收集細(xì)胞，每管加入100 μl細(xì)胞懸液，并加入FITC antimouse CD3、PE anti-mouse CD4以及 PE/Cy5 antimouse CD8a熒光抗體各2 μl，冰上避光孵育20分鐘。然后離心洗滌細(xì)胞2次，去除殘留的熒光抗體。最后以0．5 ml細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)檢測。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以±s表示，組間均數(shù)差異以t檢驗(yàn)分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 狂犬病毒G蛋白與N蛋白的表位預(yù)測及合成 對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的狂犬病毒G蛋白與N蛋白的序列進(jìn)行CTL表位以及Th表位預(yù)測。小鼠的MHCⅠ類分子包括 H-2kd、H-2Dd和 H-2Ld三個(gè)亞類，MHCⅡ類分子包括I-Ad和I-Ed兩個(gè)亞類。因此為了獲得CTL和Th表位，需要分別對(duì)這幾個(gè)亞類進(jìn)行分析與預(yù)測。對(duì)于MHCⅠ類分子，使用SYFPEITHI和BIMAS軟件進(jìn)行預(yù)測，選擇共同得分較高的4條序列。對(duì)于MHCⅡ類分子，使用RANKPEP軟件進(jìn)行預(yù)測，選擇得分較高的4條序列。以上多肽合成后經(jīng) HPLC純化，純度在91.34% ～96.65%之間。經(jīng)質(zhì)譜分析，合成的多肽實(shí)際相對(duì)分子質(zhì)量與理論相符，說明合成的多肽正確，可用于后續(xù)鑒定實(shí)驗(yàn)。所合成的多肽基本信息見表1和表2。

2．2 經(jīng)多肽刺激后淋巴細(xì)胞增殖情況 所合成的8條多肽體外刺激經(jīng)狂犬疫苗免疫后的BALB/c小鼠脾淋巴細(xì)胞，檢測淋巴細(xì)胞增殖后的OD值變化，并以刺激指數(shù)SI(Stimulation index)值表示結(jié)果，SI=實(shí)驗(yàn)孔OD值/陰性孔OD值，如圖1所示。以 SI＞2作為判斷淋巴細(xì)胞增殖陽性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)，從結(jié)果中可以看出，多肽 G367-381、G137-151、G297-311和 G333-341能夠有效刺激經(jīng)狂犬疫苗免疫后的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖(SI＞2)，同時(shí)不能引起生理鹽水對(duì)照組小鼠脾細(xì)胞的增殖(SI＜2)，因此這4條多肽具有成為表位的可能。

2．3 ELISPOT法篩選可刺激分泌IFN-γ和IL-4的多肽 為了進(jìn)一步驗(yàn)證淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果以及判斷多肽誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)的種類，使用ELISPOT法檢測經(jīng)多肽刺激的淋巴細(xì)胞分泌IL-4和IFN-γ的情況。ELISPOT結(jié)果中的每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌IFN-γ或IL-4的T淋巴細(xì)胞，稱為斑點(diǎn)形成細(xì)胞(Spot forming cell，SFC)，如圖2所示。最后結(jié)果以SFC/106個(gè)脾細(xì)胞表示，反映機(jī)體細(xì)胞免疫的水平。由圖3的結(jié)果可知，經(jīng)淋巴細(xì)胞增殖法初步篩選到的4條多肽中，G367-381及G333-341誘導(dǎo)產(chǎn)生的分泌IFN-γ和IL-4的細(xì)胞數(shù)量均顯著高于陰性對(duì)照組(P ＜0．05)，而G137-151和G297-311誘導(dǎo)產(chǎn)生的分泌IFN-γ和IL-4的細(xì)胞數(shù)量與陰性對(duì)照組并無顯著性差異(P ＞0．05)，說明G367-381及G333-341可確認(rèn)為狂犬病毒的潛在表位。而從分泌細(xì)胞因子的種類來看，這2條多肽均能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌Th1型的細(xì)胞因子 IFN-γ以及 Th2型的細(xì)胞因子 IL-4，其中G367-381主要誘導(dǎo)分泌IL-4，G333-341主要誘導(dǎo)分泌IFN-γ。在先前的表位預(yù)測中，G367-381被預(yù)測為Th表位，G333-341被預(yù)測為CTL表位，因此這一結(jié)果提示不同的細(xì)胞表位可引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)種類有所不同。

表1 狂犬病毒G蛋白與N蛋白CTL表位預(yù)測結(jié)果Tab．1 The information of the predicted CTL epitopes of glycoprotein and nucleoprotein of rabies virus

表2 狂犬病毒G蛋白與N蛋白Th表位預(yù)測結(jié)果Tab．2 The information of the predicted Th epitopes of glycoprotein and nucleoprotein of rabies virus

圖1 合成的多肽刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖Fig．1 Proliferation of spleen cells of immunized mice after stimulation of synthetic peptides

圖2 合成多肽刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4 ELISPOT斑點(diǎn)圖Fig．2 Spot forming pictures of IFN-γ-and IL-4-secreting splenocytes of immunized mice induced by synthetic peptides

2．4 流式細(xì)胞法篩選可刺激T細(xì)胞反應(yīng)的多肽為了進(jìn)一步驗(yàn)證ELISPOT篩選法的結(jié)果以及分析候選表位的種類，使用流式細(xì)胞法檢測多肽對(duì)CD4+與CD8+T細(xì)胞刺激增殖的情況。由于CD3是T細(xì)胞的特有標(biāo)記，因此以CD3設(shè)門，檢測增殖的CD3+CD4+T細(xì)胞以及CD3+CD8+T細(xì)胞占脾淋巴細(xì)胞的百分比。結(jié)果如表3顯示，G367-381及G333-341刺激增殖的CD3+CD4+T細(xì)胞以及CD3+CD8+T細(xì)胞百分比均顯著高于陰性對(duì)照組(P＜0．05)，而G137-151和G297-311刺激增殖的CD3+CD4+T細(xì)胞以及CD3+CD8+T細(xì)胞百分比與陰性對(duì)照組相比無顯著差異(P＞0．05)，這一結(jié)果與先前ELISPOT的結(jié)果相符，進(jìn)一步表明多肽G367-381及G333-341可能成為狂犬病毒的潛在表位。從誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫反應(yīng)種類來分析，2條多肽中，G367-381主要誘導(dǎo)產(chǎn)生以CD3+CD4+T細(xì)胞增殖為主的Th型免疫應(yīng)答，而G333-341則主要誘導(dǎo)產(chǎn)生以CD3+CD8+T細(xì)胞增殖為主的CTL型免疫應(yīng)答，綜合ELISPOT結(jié)果中IL-4與IFN-γ細(xì)胞因子的分泌情況，可初步確定G367-381是潛在的Th表位，而G333-341則可能成為CTL表位。

圖3 合成的多肽刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-4Fig．3 IFN-γ and IL-4 secreting in splenocytes of immunized mice induced by synthetic peptides

表3 合成多肽刺激小鼠CD3+CD4+T細(xì)胞和CD3+CD8+T細(xì)胞增殖情況Tab．3 Proliferation of CD3+CD4+T and CD3+CD8+T cells in mice induced by synthetic peptides

3 討論

現(xiàn)有的狂犬疫苗盡管能夠提供一定的保護(hù)作用，但往往存在免疫原性較差、抗體產(chǎn)生緩慢、免疫程序繁瑣等不足，在嚴(yán)重的情況下，患者還需要同時(shí)注射昂貴的免疫球蛋白進(jìn)行輔助治療［11］。機(jī)體在狂犬病毒侵入后，一般通過產(chǎn)生中和抗體以及細(xì)胞免疫反應(yīng)兩種途徑清除感染，中和抗體只能清除游離于細(xì)胞外的病毒，而對(duì)于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的病毒，只能依靠細(xì)胞免疫的殺傷作用進(jìn)行清除，因此細(xì)胞免疫對(duì)于預(yù)防和清除狂犬病毒的感染非常重要［17］。一些研究也表明，CD4+和CD8+T細(xì)胞誘導(dǎo)的Th以及CTL免疫應(yīng)答能夠通過分泌一系列細(xì)胞因子如IL-4、TNF-α、IFN-γ等在抵御狂犬病毒感染的過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用［18］。

表位疫苗作為近年來新發(fā)展起來的一種新型疫苗技術(shù)，其含有能夠被機(jī)體免疫細(xì)胞直接識(shí)別的MHC限制性多肽，能夠產(chǎn)生具有細(xì)胞殺傷作用的CTL和促進(jìn)中和抗體產(chǎn)生的Th免疫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)于清除病毒感染和提供免疫保護(hù)具有重要的作用［19，20］。目前，表位疫苗已經(jīng)在部分病毒疫苗的研究中取得了顯著的成效，如針對(duì)A型流感病毒M2蛋白的表位疫苗已經(jīng)在小鼠和恒河猴上進(jìn)行了臨床前研究，并取得了一定的效果［21］;丙型肝炎(HCV)的治療性表位疫苗經(jīng)過人體實(shí)驗(yàn)也證明了其較好的免疫原性和安全性［22］。這些結(jié)果都表明表位疫苗能夠克服傳統(tǒng)疫苗的種種不足，是一種具有廣闊前景的新型疫苗，但同時(shí)表位疫苗還存在免疫原性較弱、在體內(nèi)容易被降解等不足，需要進(jìn)一步的改進(jìn)。

研究表位疫苗首先必須篩選到合適的多肽表位，在以往篩選表位的過程中，重疊肽法是一種經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法，此方法不易發(fā)生漏選的情況，但是需要合成大量的肽段，所需時(shí)間較長，費(fèi)用較高，對(duì)于較長的蛋白序列并不適用［23］。近年來，隨著人們對(duì)MHCⅠ類及Ⅱ類分子與抗原肽結(jié)合規(guī)律的逐步認(rèn)識(shí)，用生物信息學(xué)研究細(xì)胞表位的方法已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，與重疊肽法相比，計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測能夠節(jié)省大量時(shí)間與成本，并且提高篩選的準(zhǔn)確率［24］。

本研究利用生物信息學(xué)軟件 BIMAS、SYFPEITHI以及RANKPEP對(duì)狂犬病毒的糖蛋白以及核蛋白的CTL和Th表位進(jìn)行預(yù)測，其中BIMAS和SYFPEITHI通過矩陣法分析抗原每一種氨基酸在MHCⅠ類配體特定位點(diǎn)上出現(xiàn)的頻率來預(yù)測CTL表位［12］。RANKPEP通過位置特異性打分矩陣的算法對(duì)較長片段的Th表位進(jìn)行預(yù)測，克服了之前預(yù)測軟件只對(duì)簡單序列模式進(jìn)行預(yù)測的不足，故準(zhǔn)確率較高［14］。本研究通過運(yùn)用三種生物信息學(xué)軟件，從狂犬病毒的糖蛋白與核蛋白序列中預(yù)測出8條可能成為細(xì)胞表位的多肽，并利用體外淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步篩選，以及ELISPOT和流式細(xì)胞法進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，最終獲得2條可能成為細(xì)胞表位的多肽G367-381及G333-341，并通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了G367-381能誘導(dǎo)Th型免疫應(yīng)答，是潛在的Th表位，而G333-341則可誘導(dǎo)CTL型的免疫應(yīng)答，可能成為CTL表位。

綜上所述，本研究以BALB/c小鼠為哺乳動(dòng)物模型，結(jié)合生物信息學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，預(yù)測并篩選出2條狂犬病毒蛋白的Th及CTL表位，這將為進(jìn)一步開發(fā)狂犬病毒的表位疫苗及其應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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