CCL28在類風濕關(guān)節(jié)炎患者外周血和炎癥關(guān)節(jié)中的表達①

程 昉 湯建平 張曉宇 曾 郁 房星星 龔邦東

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院風濕免疫科，上海200065)

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性滑膜炎和侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征的全身性自身免疫病。RA滑膜組織中大量炎性細胞浸潤，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞等，這些細胞由循環(huán)穿過血管內(nèi)皮外滲至炎癥關(guān)節(jié)的過程中趨化因子發(fā)揮重要作用。趨化因子分為CXC、CC、C、CX3C四類，它們通過與相應(yīng)受體相互作用調(diào)節(jié)免疫細胞的遷移。CCL28，也稱黏膜相關(guān)上皮趨化因子(Mucosa-associated epithelial chemokine，MEC)，是近年發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子［1，2］。研究表明CCL28在銀屑病、哮喘病變組織中異常高表達［2，3］，提示它參與了炎癥性疾病的發(fā)生過程。本研究觀察RA患者外周血、滑液和滑膜組織中CCL28的表達情況，探討其在RA發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 對象 44例RA患者來自同濟大學附屬同濟醫(yī)院風濕免疫科和骨科住院患者，其中男11例，女33例，平均年齡(63±11)歲，臨床診斷均符合1987年美國風濕病學會(ACR)修訂的RA分類標準，并排除其他自身免疫性疾病、感染和惡性腫瘤。正常對照組20例，均為健康體檢者，男4例，女16例，平均年齡(59±11)歲。兩組性別和年齡構(gòu)成差異無統(tǒng)計學意義。記錄RA患者的臨床資料和實驗室檢查數(shù)據(jù)，并計算疾病活動性評分(Disease activity score in 28 joints，DAS28)，根據(jù)評分將患者分為非活動期組(DAS28≤3.2)10例，活動期組(DAS28＞3.2)34例。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 外周靜脈血取自所有RA患者和正常對照者，滑液取自15例伴有膝關(guān)節(jié)積液的活動期RA患者，抗凝，離心，收集血漿和滑液，-20℃保存待測。8例RA患者經(jīng)關(guān)節(jié)手術(shù)切取滑膜標本，另取4例骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織作為對照。本研究經(jīng)同濟大學附屬同濟醫(yī)院倫理委員會批準，取得受試者知情同意后取材。

1.2.2 血漿和滑液CCL28水平檢測 采用雙抗體夾心ELISA法。人CCL28 ELISA試劑盒購自R＆D公司，操作步驟嚴格按照說明書進行，用ELx800酶標儀(美國Bio-Tek公司)測定450 nm處吸光值。

1.2.3 免疫組織化學染色 采用EnVision二步法?；そM織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，制備切片。切片脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3分鐘×3次，置于pH6.0檸檬酸鹽緩沖液微波高溫修復(fù)抗原，自然冷卻，PBS洗3次，置于Tris緩沖鹽溶液(TBS)中，3%過氧化氫室溫孵育20分鐘阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水漂洗，置于TBS中10分鐘，滴加兔抗人CCL28多克隆抗體(Gene-Tex公司，1∶500)37℃孵育1小時，PBS洗3次，加EnVision二抗(Dako公司)工作液37℃孵育30分鐘，PBS洗3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。鏡下細胞質(zhì)呈棕黃色為陽性細胞。

1.3 統(tǒng)計學處理 運用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗或配對t檢驗(符合正態(tài)分布和方差齊性)，相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 RA患者與對照組血漿CCL28水平比較(±s)Tab．1 CCL28 levels in plasma of RA patients and healthy controls(±s)

表1 RA患者與對照組血漿CCL28水平比較(±s)Tab．1 CCL28 levels in plasma of RA patients and healthy controls(±s)

Note:Compared with the active RA group without joint effusion，1)P ＜0.01;compared with the control group，2)P ＜0.05.

Groups n CCL28(pg/ml)Active RA Joint effusion 15 1 400±3381)2)No joint effusion 19 1 107±264 Inactive RA 10 988±156 Healthy controls 20 1 151±235

2 結(jié)果

2.1 血漿CCL28水平 活動期RA患者有關(guān)節(jié)積液組血漿CCL28水平高于無關(guān)節(jié)積液組(P＜0.01)和健康對照組(P＜0.05)，非活動期RA組血漿CCL28水平與健康對照組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表1。

2.2 滑液CCL28水平 有關(guān)節(jié)積液的RA患者滑液CCL28水平為(2 724±359)pg/ml，顯著高于配對血漿CCL28水平(P＜0.001)，見圖1。

圖1 RA患者血漿與滑液CCL28水平比較Fig．1 CCL28 levels in plasma and synovial fluid of RA patients

圖2 滑膜組織中CCL28的表達(EnVision免疫組化染色)Fig．2 The expression of CCL28 in synovial tissues detected by immunohistochemistry(EnVision)

2.3 CCL28水平與RA臨床和實驗室指標的關(guān)系RA患者血漿或滑液CCL28水平在類風濕因子(RF)陽性組和陰性組、抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體陽性組和陰性組之間差異無統(tǒng)計學意義，與年齡、病程、RF、抗CCP抗體、DAS28評分、血沉、C反應(yīng)蛋白亦無相關(guān)性。

2.4 滑膜組織CCL28的表達 RA患者的滑膜組織均表達CCL28，但骨關(guān)節(jié)炎患者的滑膜幾乎無CCL28表達，見圖2。CCL28表達于RA滑膜襯里層和襯里下層，陽性細胞呈胞質(zhì)染色，為巨噬細胞和中性粒細胞，而淋巴細胞、滑膜成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞無染色。

3 討論

CCL28是 2000年發(fā)現(xiàn)的 CC趨化因子，與CCL27同源性最強，約有40%的氨基酸相同［1］。CCL28廣泛表達于黏膜組織的上皮細胞，唾液腺、乳腺、結(jié)腸和直腸表達較豐富。CCR10和CCR3是CCL28的受體，CCL28可以招募表達CCR10的記憶性T淋巴細胞和IgA抗體分泌細胞，以及表達CCR3的嗜酸性粒細胞進入相關(guān)組織［1，2，4］。研究表明CCL28參與黏膜免疫，具有廣譜抗微生物活性，與炎癥、感染、腫瘤的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)［2-7］。

RA滑液和滑膜組織表達多種趨化因子，它們誘導(dǎo)外周血白細胞遷移至炎癥關(guān)節(jié)，還參與滑膜血管生成，在RA的發(fā)病機制中具有重要作用。張艷莉等［8］報道 RA患者血中 CCL28水平升高，與血沉、RF呈正相關(guān)。本研究顯示無關(guān)節(jié)積液的RA患者血漿CCL28水平與對照組無差異，而有關(guān)節(jié)積液的患者血漿CCL28升高，其滑液CCL28更高，提示RA急性起病或復(fù)發(fā)(出現(xiàn)關(guān)節(jié)積液)時外周血和滑液CCL28水平上調(diào);研究未發(fā)現(xiàn)CCL28水平與RA自身抗體及疾病活動性指標存在關(guān)聯(lián)，提示CCL28可能在關(guān)節(jié)局部發(fā)揮作用而不參與全身炎癥反應(yīng)，不能作為RA的臨床觀察指標。Tsubaki等［9］采用免疫組化研究顯示CCL28表達在RA滑膜襯里層的巨噬細胞(A型滑膜細胞)。本研究的免疫組化分析發(fā)現(xiàn)CCL28在骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織中幾乎不表達，但在RA滑膜襯里層和襯里下層均有表達，陽性細胞為巨噬細胞和中性粒細胞。雖然中性粒細胞在RA滑膜組織中的數(shù)量有限，但是它在RA滑液中非常豐富，因而可能是滑液CCL28的重要來源。以上研究中RA滑膜成纖維細胞(B型滑膜細胞)未見CCL28表達，但另有研究顯示該細胞在體外培養(yǎng)時表達 CCL28基因和蛋白［10，11］，這可能與研究方法不同、微環(huán)境的改變有關(guān)。

RA患者滑液及滑膜組織中CCL28異常高表達，其原因可能與促炎細胞因子、缺氧有關(guān)。IL-1β和TNF-α在RA發(fā)病中起關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)在黏膜上皮(氣道、結(jié)腸)IL-1β、TNF-α 可通過激活 NF-κB信號通路增加 CCL28 的產(chǎn)生［3，12］。此外，RA 滑膜增生導(dǎo)致慢性缺氧，研究顯示缺氧能上調(diào)某些細胞(RA滑膜成纖維細胞、腫瘤細胞)CCL28 的表達［7，10］。CCL28在RA發(fā)病機制中的作用如何尚不清楚，推測CCL28可能通過與淋巴細胞上的受體CCR10結(jié)合介導(dǎo)外周血CCR10+T、B淋巴細胞遷移到炎癥關(guān)節(jié)。有意思的是，F(xiàn)acciabene等［7］發(fā)現(xiàn)腫瘤缺氧誘導(dǎo)表達的CCL28能夠招募CCR10+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)，Tregs繼而促進腫瘤免疫耐受和血管生成。由于RA滑液中富含 Tregs［13］，因此CCL28與滑液 Tregs聚集和滑膜血管生成的關(guān)系值得進一步探討。

本研究中RA患者伴有關(guān)節(jié)積液時外周血CCL28水平升高，滑液CCL28又高于外周血;CCL28表達在RA滑膜襯里層和襯里下層的巨噬細胞及中性粒細胞，而對照滑膜幾乎無表達，提示CCL28參與了RA的免疫病理過程。深入研究并揭示CCL28在RA發(fā)病中的潛在作用及機制將可能為靶向趨化因子和趨化因子受體治療RA提供新的靶點。

1 Pan J，Kunkel E J，Gosslar U et al.A novel chemokine ligand for CCR10 and CCR3 expressed by epithelial cells in mucosal tissues［J］.J Immunol，2000;165(6):2943-2949.

2 Wang W，Soto H，Oldham E R et al.Identification of a novel chemokine(CCL28)，which binds CCR10(GPR2)［J］.J Biol Chem，2000;275(29):22313-22323.

3 English K，Brady C，Corcoran P et al.Inflammation of the respiratory tract is associated with CCL28 and CCR10 expression in a murine model of allergic asthma［J］.Immunol Lett，2006;103(2):92-100.

4 Hansson M，Hermansson M，Svensson H et al.CCL28 is increased in human Helicobacter pylori-induced gastritis and mediates recruitment of gastric immunoglobulin A-secreting cells［J］.Infect Immun，2008;76(7):3304-3311.

5 Hieshima K，Ohtani H，Shibano M et al.CCL28 has dual roles in mucosal immunity as a chemokine with broad-spectrum antimicrobial activity［J］.J Immunol，2003;170(3):1452-1461.

6 Dimberg J，Hugander A，W?gs?ter D.Protein expression of the chemokine，CCL28，in human colorectal cancer［J］.Int J Oncol，2006;28(2):315-319.

7 Facciabene A，Peng X，Hagemann I S et al.Tumour hypoxia promotes tolerance and angiogenesis via CCL28 and T(reg)cells［J］.Nature，2011;475(7355):226-230.

8 張艷莉，蔣 莉，張曉莉et al.常見的風濕性疾病患者血中黏膜相關(guān)上皮趨化性細胞因子水平的變化及意義［J］.中國醫(yī)科大學學報，2010;39(11):950-952.

9 Tsubaki T，Takegawa S，Hanamoto H et al.Accumulation of plasma cells expressing CXCR3 in the synovial sublining regions of early rheumatoid arthritis in association with production of Mig/CXCL9 by synovial fibroblasts［J］.Clin Exp Immunol，2005;141(2):363-371.

10 Del Rey M J，Izquierdo E，Usategui A et al.The transcriptional response of normal and rheumatoid arthritis synovial fibroblasts to hypoxia［J］.Arthritis Rheum，2010;62(12):3584-3594.

11 Frommer K W，Zimmermann B，Meier F M et al.Adiponectin-mediated changes in effector cells involved in the pathophysiology of rheumatoid arthritis［J］.ArthritisRheum，2010;62(10):2886-2899.

12 Ogawa H，Iimura M，Eckmann L et al.Regulated production of the chemokine CCL28 in human colon epithelium［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2004;287(5):G1062-G1069.

13 Oh S，Rankin A L，Caton A J.CD4+CD25+regulatory T cells in autoimmune arthritis［J］.Immunol Rev，2010;233(1):97-111.