人工關(guān)節(jié)感染翻修術(shù)后近期細(xì)菌學(xué)研究*

叢銳軍 符培亮 劉偉 李曉華 吳海山 吳宇黎 趙輝 王波

（第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院骨科，上海200003）

人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染是災(zāi)難性并發(fā)癥，可導(dǎo)致手術(shù)失敗，患者可能需要移除假體甚至截肢，帶來巨大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。1個(gè)月內(nèi)的急性感染采用保留假體、清創(chuàng)、使用抗生素治療的手術(shù)成功率為26%～70%[1,2]，而慢性感染需二期翻修[3-6]，二期翻修是感染治療的金標(biāo)準(zhǔn)[7-10]，原則是徹底清除所有異物，全身使用抗生素，局部使用抗生素骨水泥間置器，感染臨床治愈后植入翻修假體，術(shù)中行冰凍切片。對(duì)于兩次手術(shù)時(shí)間、兩種手術(shù)方式及抗生素骨水泥間置器的類型均存在爭(zhēng)議[11-14]。此外，臨床上很多患者和文獻(xiàn)中報(bào)道，即使感染臨床治愈后，部分患者會(huì)出現(xiàn)傷口周圍特發(fā)性紅腫和不明原因的濕疹，無論是否使用抗生素，這些癥狀都能得到緩解[15]。本文探索人工關(guān)節(jié)感染翻修術(shù)后近期關(guān)節(jié)和髓腔內(nèi)細(xì)菌的殘留情況，為上述爭(zhēng)議和癥狀提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康成年新西蘭大白兔64只（其中4只為備用組），雌雄不限，體重2.5～3.5 kg，平均2.8 kg（第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供），清潔級(jí)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進(jìn)食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制作與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：使用膝前外側(cè)入路，暴露兔膝關(guān)節(jié)前髁，注意保護(hù)髕腱及前髁韌帶，于負(fù)重面適當(dāng)位置開槽，避免損傷交叉韌帶和后外側(cè)神經(jīng)血管，用定制銼刀修整截骨面，植入定制型生物假體（圖1），檢查假體牢固度，確定假體位置及牢固度較好后沖洗關(guān)閉傷口。術(shù)后第2 d注入SE SAL65164金葡菌（第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室提供）1×106CFU，1周后進(jìn)行關(guān)節(jié)腔穿刺細(xì)菌培養(yǎng)，1只動(dòng)物死亡，1只穿刺培養(yǎng)未得到細(xì)菌，備用組2只替代，30只感染模型構(gòu)建成功[16]。實(shí)驗(yàn)組30只翻修術(shù)后第1～4周分別行關(guān)節(jié)灌洗液沉渣細(xì)菌培養(yǎng)和關(guān)節(jié)灌洗液沉渣遺傳物質(zhì)聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測(cè)，細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為培養(yǎng)組，PCR檢測(cè)結(jié)果為PCR組，將各時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)組陽性率和PCR組檢出率進(jìn)行組間比較，同時(shí)將不同時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)組陽性率和PCR組檢出率進(jìn)行時(shí)序性比較。此外，設(shè)立30只為陰性對(duì)照組，旨在說明未行關(guān)節(jié)翻修的關(guān)節(jié)腔內(nèi)細(xì)菌可以持續(xù)檢出，陰性對(duì)照組不用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 翻修手術(shù)：采用二期翻修手術(shù)，關(guān)節(jié)置換原切口入路，切開外側(cè)肌群后暴露兔膝關(guān)節(jié)，避免損傷髕韌帶、前髁韌帶、側(cè)副韌帶和交叉韌帶；徹底清除關(guān)節(jié)腔內(nèi)異常組織，取出原假體，雙氧水、洗必泰、生理鹽水反復(fù)沖洗浸泡后，更換手套及手術(shù)器械，實(shí)驗(yàn)組使用中空多孔關(guān)節(jié)假體＋植入式輸液港系統(tǒng)（巴德公司提供）作為間置器填充，關(guān)節(jié)假體為定制的生物型假體，出現(xiàn)嚴(yán)重骨缺損的個(gè)體采用大直徑假體，不使用骨水泥填充（圖2）；陰性對(duì)照組未行手術(shù)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物二期翻修中1例出現(xiàn)假體周圍骨折，備用組代替[11,14]。

1.2.3 圍手術(shù)期處理：每天觀察實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體溫、進(jìn)食和傷口情況，觀察遠(yuǎn)端肢體運(yùn)動(dòng)情況。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1周內(nèi)通過輸液港行關(guān)節(jié)內(nèi)腔頭孢唑啉1 g溶于500 ml生理鹽水灌洗25 min，后用生理鹽水2500 ml沖洗，全身使用頭孢唑啉0.1 gTid（肌內(nèi)注射），1周后停用抗生素。陰性對(duì)照組僅全身使用抗生素0.1gTid（肌肉注射）。

1.2.4 觀察指標(biāo)：術(shù)后第1～4周通過輸液港行關(guān)節(jié)腔內(nèi)2500 ml生理鹽水灌洗，全部灌洗液離心（6000×g，10 min），取沉渣，兩等分，分別用于細(xì)菌培養(yǎng)[17]和PCR檢測(cè)23S rRNA基因、nuc基因[18,19]。細(xì)菌培養(yǎng)條件為5%去纖維羊血培養(yǎng)基，37℃恒溫增菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，陰性結(jié)果繼續(xù)培養(yǎng)1周，陽性結(jié)果行過氧化氫實(shí)驗(yàn)和凝固酶實(shí)驗(yàn)，并抽提DNA鑒定菌株類型。

1.2.5 DNA抽提和PCR方法：使用QIAamp DNA套裝（Qiagen，德國(guó)）提取DNA。PCR反應(yīng)體系每30 μl包含1 μl nuc引物或23S rRNA引物10 pmol（Invitrogen，美國(guó)），5 μl DNA 模版，14 μl PCR 液（DNA聚合酶MgCl2,dNTPs）（Roche，德國(guó)），9 μl蒸餾水，自動(dòng)擴(kuò)增儀Mastercycler（Eppendorf，德國(guó)）完成擴(kuò)增（表1）。二期翻修術(shù)后第4周，隨機(jī)處死實(shí)驗(yàn)組15只，分別取假體周圍、髓腔中段、髓腔遠(yuǎn)端組織，冰凍切片后革蘭氏染色找金葡菌（圖3），并取部分組織塊增菌培養(yǎng)，并行過氧化氫實(shí)驗(yàn)和凝固酶實(shí)驗(yàn)[17,20]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)對(duì)實(shí)驗(yàn)者和統(tǒng)計(jì)員雙盲。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，使用配對(duì)樣本Pearson卡方分析比較各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)組陽性率和PCR組檢出率的組間差異，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；使用Pearson卡方分析兩兩比

較不同時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)組陽性率和PCR組檢出率的時(shí)序性差異，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組大體觀察

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后體溫均正常、傷口愈合好，術(shù)后第3周縫線開始陸續(xù)脫落，遠(yuǎn)端肢體運(yùn)動(dòng)好，進(jìn)食量未見明顯減少；對(duì)照組術(shù)后7只體溫升高，進(jìn)食量減少，傷口紅腫、滲出、愈合差，術(shù)后3～4周，其中4只竇道形成，每天換藥可見淡黃色膿性滲出物5～20 ml，細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)為凝固酶陽性、過氧化氫酶陽性、革蘭氏陽性球菌，DNA鑒定為SE SAL65164金葡菌株，其中1只同時(shí)檢出革蘭氏陰性桿菌。

2.2 實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果和PPCCRR檢測(cè)結(jié)果

術(shù)后第1周灌洗液呈棕紅色、懸濁液，離心后得到灰紅色沉淀3.6 g，第2周灌洗液呈淡紅色、懸濁液，離心后得到灰白色沉淀3.2 g，第3周灌洗液為無色透明懸液，離心后得到灰白色沉淀3.5 g，第4周灌洗液為無色透明懸液，沉淀后得到黃白色沉淀3.0 g。細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果示：術(shù)后第1～4周培養(yǎng)組陽性率分別為10%、3.33%、3.33%、3.33%7只標(biāo)本有細(xì)菌生長(zhǎng)，余未見細(xì)菌生長(zhǎng)，細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)示凝固酶陽性葡萄球菌，DNA鑒定為SE SAL65164金葡菌株；第2～4周，其中1只可見細(xì)菌生長(zhǎng)，余未見細(xì)菌生長(zhǎng)。術(shù)后第4周處死的實(shí)驗(yàn)組15只冰凍切片革蘭氏染色，該只股骨后側(cè)肌肉組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性球菌存在，同部位組織塊血培養(yǎng)基培養(yǎng)，見凝固酶陽性、過氧化氫酶陽性球菌生長(zhǎng)，DNA鑒定為SE SAL65164金葡菌株。PCR檢測(cè)特定23S rRNA基因和nuc基因的組內(nèi)分布結(jié)果示：術(shù)后第1～4周兩種基因的組內(nèi)分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其檢出率分別為83.33%、40.00%、30.00%、26.67%（表2、3）。

2.3 各時(shí)間點(diǎn)的組間差異和各組的時(shí)序性差異

實(shí)驗(yàn)組二期翻修術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)組結(jié)果和PCR組結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表4），認(rèn)為術(shù)后第1～4周灌洗液沉淀物的細(xì)菌培養(yǎng)陽性率和PCR檢出率不一致，且細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果均低于PCR檢測(cè)結(jié)果。各組的時(shí)序性比較發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組二期翻修術(shù)后第1～4周的PCR組結(jié)果持續(xù)下降，第1周的PCR檢出率與第2～4周比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001,0.000,0.000），而第2～4周之間無顯著性差異（圖4）。術(shù)后細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果時(shí)序分析顯示，術(shù)后第1～4周的細(xì)菌培養(yǎng)陽性率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.605）。第1周的細(xì)菌培養(yǎng)陽性率和PCR檢出率與陰性對(duì)照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，認(rèn)為實(shí)驗(yàn)組干預(yù)有效，細(xì)菌培養(yǎng)陽性率與PCR檢率率的差別并非由假陽性誤差偏倚引起。

表2 實(shí)驗(yàn)組翻修術(shù)后第1～4周23S rRNA和nuc基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

表3 對(duì)照組翻修術(shù)后第4周23S rRNA和nuc基因的PCR檢測(cè)結(jié)果

表4 實(shí)驗(yàn)組翻修術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)菌培養(yǎng)組陽性率和PPCCRR組檢出率比較（%%）

3 討論

目前關(guān)節(jié)周圍感染的治療方式包括清創(chuàng)保留假體抗生素治療、一期清創(chuàng)+翻修術(shù)、二期翻修術(shù)。早期的大樣本關(guān)節(jié)置換感染認(rèn)為：抗生素骨水泥假體二期翻修，平均隨訪4.8年，手術(shù)成功率超過80%，近期研究認(rèn)為生物型假體一期翻修，隨訪3～4年，可以得到相似的結(jié)果，Soriano等[2]認(rèn)為急性感染2周內(nèi)，細(xì)菌菌膜未形成前行關(guān)節(jié)清創(chuàng)術(shù)，保留假體治療后，感染再發(fā)率達(dá)30%；本實(shí)驗(yàn)在輸液港幫助下，全身、局部使用抗生素，合并局部灌洗治療1周后，灌洗液細(xì)菌培養(yǎng)陽性率為10%，金葡菌遺傳物質(zhì)檢出率為83.33%，作者認(rèn)為急性感染單純清創(chuàng)治療的有效率值得商榷。二期翻修放置spacer填充雖增加了手術(shù)次數(shù)，但細(xì)菌清除率得到保證，實(shí)驗(yàn)中的中空假體+輸液港裝置可實(shí)現(xiàn)術(shù)后實(shí)時(shí)灌洗和關(guān)節(jié)液培養(yǎng)，同時(shí)減少置管的逆向感染等問題，減少患者創(chuàng)傷。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)無論一期手術(shù)還是二期翻修的前提是徹底清除細(xì)菌，關(guān)節(jié)周圍感染主要是革蘭陽性球菌，其中以金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌為主。文獻(xiàn)報(bào)道，即使在嚴(yán)格傷口護(hù)理及每天換藥的情況下，不同時(shí)間培養(yǎng)得到的細(xì)菌亦可能不一致，本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中1只出現(xiàn)類似情況。該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因未見文獻(xiàn)報(bào)道。文獻(xiàn)證實(shí)，隨著生存環(huán)境的變化細(xì)菌會(huì)改變以適應(yīng)環(huán)境；關(guān)節(jié)腔內(nèi)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，滑膜組織和肌肉間隙非常多，當(dāng)處于休眠狀態(tài)的細(xì)菌被包裹在這些軟組織間隙時(shí)，是否會(huì)引起機(jī)體的炎癥反映，是否具有趨化作用和免疫源性，目前尚未得到研究。清創(chuàng)后4周內(nèi)，雖然細(xì)菌培養(yǎng)未見細(xì)菌生長(zhǎng)，但細(xì)菌遺傳物質(zhì)不斷被檢出，且兩者間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，抗生素的抑制作用、細(xì)菌生物活性改變、死亡細(xì)菌的遺傳物質(zhì)殘留都會(huì)導(dǎo)致這種差異，有待進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)菌活性、毒性和基因分型等。

關(guān)節(jié)液內(nèi)無血液，無法形成有效抗菌環(huán)境，當(dāng)內(nèi)環(huán)境適宜時(shí)殘留的細(xì)菌和死亡細(xì)菌的遺傳物質(zhì)會(huì)再次成為危險(xiǎn)因素。新的細(xì)菌定植時(shí)，致病因子的基因通過轉(zhuǎn)座作用整合在新細(xì)菌體內(nèi)，如一些細(xì)菌形成菌膜的能力和一些細(xì)菌耐藥性的獲得是通過鞭毛交換遺傳物質(zhì)實(shí)現(xiàn)的，因此局部大量檢出金葡菌遺傳物質(zhì)亦為危險(xiǎn)因素[21-23]。即使是遺傳物質(zhì)本身，再次入血也會(huì)導(dǎo)致超敏反應(yīng)發(fā)生。

時(shí)序檢測(cè)證實(shí)細(xì)菌的遺傳物質(zhì)檢出率隨時(shí)間延長(zhǎng)而急劇下降，且細(xì)菌培養(yǎng)的陽性率也有所下降，作 者推測(cè)與輸液港的沖洗作用和組織的代謝密切相關(guān)，增加手術(shù)間隔對(duì)提高翻修手術(shù)的成功率非常有意義。本實(shí)驗(yàn)中1只持續(xù)細(xì)菌培養(yǎng)陽性可能與清創(chuàng)不徹底、間隙內(nèi)細(xì)菌殘留并持續(xù)釋放有關(guān)，臨床指標(biāo)持續(xù)不下降應(yīng)考慮穿刺或灌洗培養(yǎng)，只要細(xì)菌培養(yǎng)陽性應(yīng)盡快二次清創(chuàng)，并徹底尋找隱藏細(xì)菌[24]。

綜上所述，關(guān)節(jié)翻修術(shù)后細(xì)菌在關(guān)節(jié)腔內(nèi)的分布非常復(fù)雜，一期清創(chuàng)手術(shù)的選擇應(yīng)非常慎重；遺傳物質(zhì)的殘存作為潛在危險(xiǎn)因素可帶來臨床癥狀，遺傳物質(zhì)殘存在感染復(fù)發(fā)和細(xì)菌變異中的作用值得深入研究。

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