SPE－UPLC－MS／MS快速測(cè)定豆制品中的烏洛托品

周秀云，趙 勇，俞 婧

（1.鹿泉市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河北 鹿泉 050200；2.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091）

烏洛托品，學(xué)名六亞甲基四胺（hexamethylenetetramine，C6H12N4），是甲醛和氨的縮合物，為白色具有光澤的結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，能發(fā)生眾多化學(xué)反應(yīng)，在酸性溶液中能分解放出甲醛和氨，易與體內(nèi)多種化學(xué)結(jié)構(gòu)的受體發(fā)生反應(yīng)，使蛋白質(zhì)變性。甲醛在體內(nèi)還可還原為甲醇，對(duì)人體的腎、肝、中樞神經(jīng)、免疫功能、消化系統(tǒng)等均有損害。因此，我國(guó)明令禁止將烏洛托品添加到食品當(dāng)中。近年來(lái)，一些不法廠家在豆制品中添加烏洛托品來(lái)改善豆制品的顏色，增加口感，防治腐敗變質(zhì)等。隨著人們對(duì)食品安全的關(guān)注，豆制品的安全性已成為關(guān)注的焦點(diǎn)之一。為此，筆者對(duì)豆制品中烏洛托品的檢測(cè)進(jìn)行了研究。

目前，關(guān)于烏洛托品的檢測(cè)，國(guó)標(biāo)法只發(fā)布了動(dòng)物源食品的檢測(cè)方法［8］，對(duì)于豆制品的檢測(cè)目前尚未有標(biāo)準(zhǔn)建立。烏洛托品的檢測(cè)方法，目前主要有分光光度法［1］，高效液相色譜法［2］，高效氣相色譜法［3，4］，激光拉曼光譜等［5］。其中分光光度法具有儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，易于進(jìn)行的特點(diǎn)，但檢測(cè)的干擾較大，靈敏度較低；高效氣相色譜法和高效液相色譜法具有準(zhǔn)確，線性好，回收率高的特點(diǎn)，研究報(bào)道較多，但檢測(cè)的靈敏度不高。高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法［6，7］除了具備高效液相色譜所具有的準(zhǔn)確度高，線性好等特點(diǎn)外，還具有更低的檢測(cè)限，更高的檢測(cè)靈敏度，可以為豆制品中烏洛托品的檢測(cè)提供高靈敏度的分析方法。本研究擬采用超高相液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定豆制品中的烏洛托品，以期為豆制品中烏洛托品的檢測(cè)提供技術(shù)支持，同時(shí)加速豆制品中烏洛托品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的建立進(jìn)程。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 儀器與材料

UPLC－MS／MS8030超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀；固相萃取裝置（美國(guó)Agilent公司），ProElut PXA 固相萃取柱（150mg／6ml，迪馬科技）。

1.2 試劑

烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)于Sigma，純度＞99.0%），乙酸、乙腈為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.3 分析步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置

準(zhǔn)確稱取烏洛托品標(biāo)準(zhǔn)品0.1g，用乙腈溶解并定容至100mL，搖勻備用，配制成濃度為1.00mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再?gòu)纳鲜鰳?biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液中分別吸取1.00mL、2.00mL、4.00mL、8.00mL、16.00mL 于5 個(gè)100mL 容量瓶中，并用乙腈定容至刻度，配制濃度分別為10ug／mL、20ug／mL、40ug／mL、80ug／mL、160ug／mL系列標(biāo)準(zhǔn)使用液，混勻后即可進(jìn)樣。以標(biāo)樣峰面積的比值對(duì)應(yīng)烏洛托品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立相應(yīng)的回歸方程。

1.3.2 樣品處理

提取：將1.0g（已粉碎均勻）樣品和1.0g無(wú)水硫酸鈉置于20mL 塑料離心管中，加入5mL乙腈，渦旋混合2min，超聲20min，6000rpm 下離心5min。取上清液，待凈化。

凈化：將提取液上樣于已與5mL乙腈活化的ProElut PXA 固相萃取小柱，收集流出液后采用1mL乙腈洗脫，流出液合并洗脫液在45℃下氮吹近干，最后用1mL 0.1%乙酸－乙腈溶解，過(guò)0.22μm 濾膜，待測(cè)。

1.4 檢測(cè)條件

色譜柱：shim－pack XR－ODSⅢ（2.0mm＊75mm，1.6μm）；流速：0.3mL／min；流動(dòng)相A：0.1%乙酸水，60%；流動(dòng)相B：乙腈，40%；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

質(zhì)譜方式：電離方式：ESI＋；反應(yīng)監(jiān)控掃描（MRM）模式；毛細(xì)管電壓：3.5kV；源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃；脫溶劑氣流量：600L／h。

2 結(jié)果與討論

2.1 SPE柱的選擇

利用固相萃取小柱（SPE）中的固體吸附劑吸附樣品中的雜質(zhì)，使被測(cè)物質(zhì)被洗脫并雜質(zhì)分離，達(dá)到進(jìn)一步分離目標(biāo)化合物的目的。比較了C18、ProElut PXA 和OasisMCX3種不同類型的固相萃取柱的凈化效果。其中ProElut PXA 和OasisMCX 的凈化效果接近，優(yōu)于C18，但ProElut PXA 價(jià)格略低于OasisMCX，故采用ProElut PXA 作為本實(shí)驗(yàn)凈化用SPE柱。試驗(yàn)在空白試樣中添加濃度均為10.0μg／kg的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，平行3次使用試驗(yàn)ProElut PXA 固相萃取，各物質(zhì)回收率在82.9%～100.8%之間，滿足檢測(cè)要求。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

由于烏洛托品負(fù)電子結(jié)構(gòu)本，故實(shí)驗(yàn)采用正離子電離模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM，測(cè)定，由于采用超高效液相色譜分離技術(shù)，使得樣品測(cè)定可在1min內(nèi)完成，流速設(shè)定為2.0mL／min，峰與雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)了基線分離，最佳質(zhì)譜條件如表1，各組分具有良好的分離度、響應(yīng)值及離子碎片，見(jiàn)圖1、圖2。

表1 烏洛托品的質(zhì)譜分析優(yōu)化參數(shù)

圖1 烏洛托品的標(biāo)準(zhǔn)MRM 色譜圖

圖2 烏洛托品的標(biāo)準(zhǔn)子離子碎片色譜圖

2.3 靈敏度

以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x），定量離子對(duì)色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），求得回歸方程y＝35.1600x－0.648027。烏洛托品在10.0～160μg／kg范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。

以3倍信噪比（S／N＝3）對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限，以10倍性噪比（S／N＝10）對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為定量限，得到烏洛托品的方法檢出限和定量限分別為3μg／kg和1μg／kg，見(jiàn)圖3。

圖3 烏洛托品檢出限的標(biāo)準(zhǔn)MRM 色譜圖

2.4 回收率及精密度

本方法用于市場(chǎng)銷售的實(shí)際樣品測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，空白樣品中分別添加5，20，100μg／kg標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行回收率試驗(yàn)。表2是添加3個(gè)水平的回收率及精密度。由數(shù)據(jù)可以看出，烏洛托品在三種添加水平下平均回收率為88.4%～97.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.39%～8.74%，能夠滿足豆制品中痕量烏洛托品檢測(cè)的需要。

表2 不同添加水平下烏洛托品的加標(biāo)回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝6）

3 結(jié)論

本研究工作中所建立的SPE－UPLC－MS／MS法測(cè)定豆制品中烏洛托品的檢測(cè)方法，樣品前處理提取率高、有機(jī)溶劑使用量少，方法靈敏度高，選擇性和特異性好，采用超高效液相色譜技術(shù)有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，結(jié)果準(zhǔn)確。本方法的回收率、精密度和檢出限優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道值。本方法的定量限可保證豆制品中烏洛托品的定性與定量檢測(cè)，是測(cè)定豆制品中非食用物質(zhì)烏洛托品的一種可供選擇的方法。

［1］辛志偉，臧志和，趙小玉，等.分光光度法測(cè)定烏洛托品含量的研究［J］.數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2001，14（5）：569－570.

［2］李莉，張鋼平.高效液相色譜法測(cè)定烏洛托品片的含量［J］.中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2009，（4）：335－336.

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［5］劉春偉，仲雪，馬寧.激光拉曼光譜法快速測(cè)定腐竹中的微量烏洛托品［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2012，3（4）：306－308.

［6］冼燕萍，陳立偉，羅東輝，等.UPLC－MS／MS 測(cè)定腐竹和米粉中的烏洛托品［J］.江南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，（11）：78－82.

［7］張愛(ài)芝，張書芬，王全林，等.超高壓液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定腐竹、米線、年糕中的烏洛托品［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)2013，（4）：472－478.

［8］SN／T 2226－2008進(jìn)出口動(dòng)物源性食品中烏洛托品殘留量的檢測(cè)方法液相色譜－質(zhì)譜／質(zhì)譜法.