膠體金免疫層析試劑盒對(duì)甲型H1N1流感病毒(2009)抗原快速檢測(cè)的敏感性分析

田 棣，何 靜，劉 祎，張萬(wàn)菊，徐 磊，陳功祥，周志統(tǒng)，胡蕓文

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心病原體檢測(cè)與生物安全部，上海 201508;2.浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心，浙江 杭州 310009)

流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，可引起地方性或世界性范圍的大流行[1]。2009年4月以來(lái)，一種新型的甲型H1N1流感在全球范圍內(nèi)流行，引起廣泛的關(guān)注和重視。在大規(guī)模爆發(fā)的流感疫情中，首先需要快速查明病原體，才能對(duì)疫情控制以及患者治療提供幫助。目前甲型H1N1病毒(2009)的檢測(cè)方法主要是逆轉(zhuǎn)錄(RT)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和實(shí)時(shí)熒光PCR核酸檢測(cè)法[2]，但此法對(duì)技術(shù)要求高，且用時(shí)較長(zhǎng)。而常用的膠體金免疫層析法出結(jié)果較快，操作簡(jiǎn)單，不需要特定的場(chǎng)所和儀器設(shè)備?；诖耍狙芯恳詫?shí)時(shí)熒光定量PCR(FQ-PCR)核酸檢測(cè)結(jié)果為參考，對(duì)膠體金免疫層析試劑盒在甲型H1N1流感病毒(2009)抗原快速檢測(cè)的敏感性和特異性進(jìn)行了較為全面的分析。通過(guò)比較2種方法之間的相關(guān)性以及對(duì)不同病程、不同病毒核酸載量標(biāo)本檢測(cè)的敏感性，為甲型 H1N1流感病毒(2009)的快速篩查提供依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.標(biāo)本與來(lái)源 標(biāo)本來(lái)自上海市公共衛(wèi)生臨床中心2009年5至11月收治的疑似新甲型H1N1流感病例。采集標(biāo)本均為鼻咽拭子，放置于帶有3 mL保存液的專用標(biāo)本管中，分裝后－80℃低溫冰箱保存。

2.試劑與儀器 RNA提取試劑盒為德國(guó)QIAGEN公司產(chǎn)品(QIAamp viral RNA mini kit，Cat.No.52904);FQ-PCR試劑盒選用上海科華生物工程股份有限公司的甲型通用型和甲型H1N1流感病毒(2009)RNA檢測(cè)試劑盒(熒光PCR，批號(hào)為20090710);膠體金免疫層析試劑盒由杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司提供，甲型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒批號(hào)為FA110101，甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒批號(hào)為FA110101;Mastercycler ep relplex PCR儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

二、方法

1.FQ-PCR核酸檢測(cè)和拷貝數(shù)測(cè)定 按照試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)通道分別為FAM(H1N1信號(hào))及VIC(Flu A信號(hào))。結(jié)果判斷:在陰陽(yáng)性對(duì)照均成立的條件下，Ct＜36為陽(yáng)性;Ct≥40或無(wú)數(shù)值為陰性;36＜Ct＜40重測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果Ct＜36為陽(yáng)性，否則為陰性。H1N1及Flu A信號(hào)均為陽(yáng)性判為甲型H1N1流感病毒(2009)陽(yáng)性。

2.膠體金免疫層析法甲型流感病毒檢測(cè) 按各自的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，直接滴入解凍標(biāo)本，等待15 min即可觀察結(jié)果。當(dāng)試紙條判定部T、C處都確認(rèn)有條帶時(shí)，結(jié)果判為陽(yáng)性。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，膠體金免疫層析法與FQ-PCR的檢測(cè)結(jié)果比較采用一致性檢驗(yàn);檢測(cè)結(jié)果與病程及核酸載量的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析和Logistic回歸分析;用幾何平均數(shù)計(jì)算核酸載量平均值;陰陽(yáng)性標(biāo)本的載量經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后采用t檢驗(yàn)進(jìn)行平均值比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、膠體金免疫層析試劑盒檢測(cè)與FQ-PCR核酸檢測(cè)的比較

171例疑似甲型H1N1流感(2009)病例的鼻咽拭子標(biāo)本，經(jīng)FQ-PCR核酸檢測(cè)確認(rèn)甲型H1N1流感病毒(2009)陽(yáng)性151例、陰性20例。以甲型H1N1流感病毒(2009)PCR核酸檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，甲型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒的敏感性39.1%(59/151)，特異性 90.0%(18/20);甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒的敏感性31.8%(48/151)，特異性90.0%(18/20)。甲型流感病毒抗原檢測(cè)與PCR-熒光探針?lè)ê怂釞z測(cè)結(jié)果的一致率Pa值為45.0%，在檢測(cè)結(jié)果無(wú)關(guān)聯(lián)的假定下期望一致率Pe值為39.1%，Kappa值為0.098;甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)與PCR-熒光探針?lè)ê怂釞z測(cè)結(jié)果的一致率Pa值為38.6%，在檢測(cè)結(jié)果無(wú)關(guān)聯(lián)的假定下期望一致率 Pe值為34.2%，Kappa 值為 0.068，見(jiàn)表1。

二、膠體金免疫層析試劑盒對(duì)不同病程標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果比較

根據(jù)標(biāo)本采集病例的發(fā)病天數(shù)將171例標(biāo)本分成為1～、3～和5～d 3組，甲型流感病毒抗原試劑盒檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為66.7%、32.6%和27.3%;甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性率分別為62.5%、26.1%和20.0%，見(jiàn)表2。2種試劑盒的檢測(cè)陽(yáng)性率與標(biāo)本的病程均呈負(fù)相關(guān)(分別為Spearman相關(guān)系數(shù)－0.212，P ＜0.01和 Spearman相關(guān)系數(shù)為 －0.242，P ＜0.01)，且為線性關(guān)系(分別為 χ2=8.59，P ＜0.01 和 χ2=11.18，P ＜0.01)。

表1 膠體金免疫層析法和PCR的檢測(cè)結(jié)果比較

表2 不同病程標(biāo)本的膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果

三、膠體金免疫層析試劑盒對(duì)不同病毒核酸載量標(biāo)本檢測(cè)的敏感性比較

1.在151例甲型H1N1流感病毒(2009)PCR核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本中，膠體金免疫層析法甲型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本核酸載量平均值為(2.41 ±1.55)×107拷貝/mL，檢測(cè)陰性的標(biāo)本核酸載量平均值為(1.13±1.41)×106拷貝/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.48，P ＜0.0001);膠體金免疫層析法甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性的標(biāo)本核酸載量平均值為(5.09±1.56)×107拷貝/mL，檢測(cè)陰性的標(biāo)本核酸載量平均值為(1.11 ±1.38)×106拷貝/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.85，P ＜0.0001)。

2.根據(jù)病毒核酸載量將151例甲型H1N1流感病毒(2009)PCR核酸檢測(cè)陽(yáng)性標(biāo)本分成≥108、107～、106～、105～ 和 ＜105拷貝/mL 5 組。以甲型H1N1流感病毒(2009)核酸檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，膠體金免疫層析法甲型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒的敏感性分別為 73.3%、51.7%、36.7%、18.8%和16.7%;膠體金免疫層析法甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒的敏感性分別為73.3%、41.4%、26.7%、12.5%和 6.7%，見(jiàn)表 3。2種試劑盒的敏感性與標(biāo)本的病毒核酸載量均呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.424，P＜0.01和0.492，P ＜0.01)，且為線性關(guān)系(分別為χ2=27.06，P ＜0.01 和 χ2=36.48，P ＜0.01)。

表3 不同病毒核酸載量的膠體金免疫層析法檢測(cè)結(jié)果

四、膠體金免疫層析法的理論敏感性分析

由于膠體金試劑盒要求將標(biāo)本加入到0.5 mL的抽提液后立即檢測(cè)，而本研究采用了低溫凍存的咽拭子標(biāo)本，其采集時(shí)加入了3 mL的專用標(biāo)本采集液，相當(dāng)于將標(biāo)本的濃度稀釋了約6倍。為了評(píng)價(jià)上述情況對(duì)膠體金免疫層析試劑敏感性的影響，我們進(jìn)一步對(duì)病毒載量與敏感性的關(guān)系進(jìn)行Logistic回歸分析。假設(shè)試劑敏感性為M，病毒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為L(zhǎng)，甲型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒、甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒的敏感性為 MA、MA+B，則:

根據(jù)這個(gè)公式，我們可以推算出，2種試劑盒在發(fā)病后1～2 d取樣，標(biāo)本的理論敏感性分別為77.3%和 74.6%。

討 論

流感病毒容易發(fā)生變異，其抗原性變異與流感的發(fā)生、流行密切相關(guān)[1]，在流感爆發(fā)流行期早期快速診斷對(duì)于疫情防控至關(guān)重要，目前流感病毒常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法包括病毒培養(yǎng)、免疫熒光、核酸檢測(cè)和血清學(xué)檢測(cè)法等。當(dāng)甲型H1N1流感病毒(2009)開(kāi)始在全球范圍內(nèi)流行后，世界衛(wèi)生組織 (WHO)以及美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)推薦的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法均為RTPCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR[3-4]。但這些方法需要特殊儀器設(shè)備，操作復(fù)雜且耗時(shí)較長(zhǎng)，難以在醫(yī)院發(fā)熱門(mén)診和海關(guān)口岸開(kāi)展現(xiàn)場(chǎng)篩查。膠體金免疫層析法作為一種快速抗原檢測(cè)技術(shù)，操作簡(jiǎn)便，可在15 min左右得到結(jié)果，適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中，膠體金免疫層析法快速抗原檢測(cè)對(duì)新型甲型流感病毒的敏感性各不相同。Drexler等[5]發(fā)現(xiàn)膠體金免疫層析法快速檢測(cè)試劑對(duì)甲型H1N1流感病毒(2009)的敏感性只有11%，對(duì)2007至2008年及2008至2009年間的季節(jié)性流感病毒敏感性為37.5%和51.9%。而同種試劑在 Faix等[6]的研究中對(duì)甲型 H1N1流感病毒(2009)的敏感性為51%;在Uyeki等[7]的研究中對(duì)季節(jié)性流感病毒的敏感性只有27%。在國(guó)內(nèi)關(guān)于膠體金免疫層析法檢測(cè)甲型H1N1流感病毒(2009)的文獻(xiàn)中，鄭海潮等[8]報(bào)道的敏感性為35.6%;尤鳳興等[9]報(bào)道的敏感性為 44.8%;穆煜等[10]報(bào)道的敏感性為 66.7%;程曉東等[11]報(bào)道的敏感性為 78.1%;而石漢振等[12]報(bào)道的敏感性則高達(dá)96.7%。本研究中使用膠體金免疫層析法甲型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒、甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒檢測(cè)甲型H1N1流感病毒(2009)，以PCR核酸檢測(cè)結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，2種試劑盒的敏感性分別為39.1%和31.8%，與PCR檢測(cè)一致性均較差(Kappa值＜0.4)。一致性檢驗(yàn)的結(jié)果與張素美等[13]、賈寧等[14]的報(bào)道基本相符，說(shuō)明膠體免疫層析法檢測(cè)甲型H1N1流感病毒(2009)的敏感性存有一定的局限性。

我們分析導(dǎo)致各膠體金免疫層析試劑敏感性差異的原因，可能與各試劑生產(chǎn)廠家所采用的抗體和載體等原材料不同有關(guān)，且采用不同的參比標(biāo)準(zhǔn)得到的敏感性也會(huì)不同。比如在魏娟等[15]的報(bào)道中，同種膠體金免疫層析試劑與病毒培養(yǎng)相比的敏感性為63.6%，而與RT-PCR相比的敏感性則為73.8%。而本研究的結(jié)果提示，采樣時(shí)間以及體內(nèi)病毒載量等因素也是影響其敏感性的關(guān)鍵因素。我們對(duì)不同病程標(biāo)本的檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒、甲型/乙型流感病毒抗原檢測(cè)試劑盒的陽(yáng)性率在發(fā)病早期1～2 d時(shí)分別為66.7%和62.5%，發(fā)病后期5～d時(shí)分別為27.3%和20.0%;檢測(cè)陽(yáng)性率隨病程延長(zhǎng)而下降，兩者呈線性負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步對(duì)膠體金免疫層析法在不同病毒載量陽(yáng)性標(biāo)本中的檢測(cè)敏感性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)病毒載量≥108拷貝/mL時(shí)，2種試劑盒的敏感性均可達(dá)73.3%;而＜105拷貝/mL時(shí)，2種試劑盒的敏感性分別只有16.7%和6.7%;檢測(cè)敏感性隨著病毒核酸載量的降低而下降，兩者間呈線性正相關(guān)(P＜0.01)。另外，試劑盒說(shuō)明書(shū)要求采集的鼻咽拭子標(biāo)本應(yīng)加入0.5 mL的抽提液后立即檢測(cè)，而本研究中的鼻咽拭子標(biāo)本加入了3 mL的專用標(biāo)本采集液，相當(dāng)于稀釋了6倍左右，可能對(duì)敏感性有所影響。因此，我們對(duì)檢測(cè)敏感性進(jìn)行了Logistic回歸分析，推測(cè)2種試劑盒在發(fā)病早期1～2 d取樣時(shí)的理論敏感性分別可達(dá)77.3%和74.6%，此理論值與國(guó)外Lee等[16]的報(bào)道基本相符。

本研究結(jié)果表明，盡管以膠體金免疫層析試劑盒檢測(cè)甲型H1N1流感病毒(2009)的敏感性仍有一定的局限性，但是其在發(fā)病早期及病毒載量較高時(shí)仍有較好的檢測(cè)效果。流感作為第1個(gè)實(shí)行全球性監(jiān)測(cè)的傳染病，其危害引起人們的廣泛關(guān)注。當(dāng)流感病毒發(fā)生抗原性變異導(dǎo)致新的病毒株產(chǎn)生時(shí)，則會(huì)出現(xiàn)局部及至全球性大流行[1]。鑒于膠體金免疫層析法流感病毒抗原檢測(cè)試劑還同時(shí)具備操作簡(jiǎn)便、需時(shí)較短、結(jié)果判斷容易、不需要特殊儀器設(shè)備、處理大量標(biāo)本更為快速方便等諸多優(yōu)點(diǎn)，我們認(rèn)為其可在流感病毒大范圍流行時(shí)，在醫(yī)院發(fā)熱門(mén)診以及機(jī)場(chǎng)、海關(guān)、學(xué)校等現(xiàn)場(chǎng)用于早期診斷，有效幫助快速篩查發(fā)病早期的患者和疑似患者。但是鑒于膠體金免疫層析法自身的局限性，其結(jié)果只能作為初步參考，最終的確認(rèn)結(jié)果應(yīng)以PCR結(jié)果為準(zhǔn)。

[1]郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)三峽出版社，1997:1-4.

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.甲型H1N1流感診療方案(2010年版)[S].衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]79號(hào)，MOHC，2010.

[3]World Health Organization.WHO guidelines for pharmacological management of pandemic influenza A(H1N1)2009 and other influenza viruses[EB/OL].(2010-03-09)[2010-12-15].http://www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/h1n1_guidelines_pharmaceutical_mngt.pdf.

[4]Centers for Disease Control and Prevention(CDC).Guidance for clinicians on the use of rapid influenza diagnostic tests for the 2010-2011 influenza season[EB/OL].(2010-12-22)[2011-03-15].http://www. cdc. gov/flu/pdf/professionals/diagnosis/clinician_guidance_ridt.pdf.

[5]Drexler JF，Helmer A，Kirberg H，et al.Poor clinical sensitivity of rapid antigen test for influenza A pandemic(H1N1)2009 virus[J].Emerg Infect Dis，2009，15(10):1662-1664.

[6]Faix DJ，Sherman SS，Waterman SH.Rapid-test sensitivity for novel swine-origin influenza A(H1N1)virus in humans[J].N Engl J Med，2009，361(7):728-729.

[7]Uyeki TM，Prasad R，Vukotich C，et al.Low sensitivity of rapid diagnostic test for influenza[J].Clin Infect Dis，2009，48(9):e89-e92.

[8]鄭海潮，馬超鋒，安建博，等.兩種國(guó)產(chǎn)甲型流感病毒抗原試劑檢測(cè)2009 H1N1流感病毒敏感性實(shí)驗(yàn)研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25(3):102-103.

[9]尤鳳興，居麗雯，張敬平，等.流感病毒快速檢測(cè)方法特異性和敏感性研究[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，24(8):598-601.

[10]穆 煜，于俊峰，常 曉，等.快速甲型/乙型流感抗原篩查試驗(yàn)與H1N1 PCR檢測(cè)結(jié)果的比較與評(píng)價(jià)[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2010，28(2):105-106.

[11]程曉東，袁 權(quán)，蘇明權(quán)，等.新甲型H1N1流感和季節(jié)性流感臨床快速診斷的研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25(3):61-64.

[12]石漢振，鄭智明，黃憲章，等.免疫層析法用于甲型H1N1流感病毒抗原篩查的初步評(píng)價(jià)[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26(6):402-404.

[13]張素美，李魯英，孟保平，等.兩種甲型H1N1流感病毒檢測(cè)方法的比較[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志(電子版)，2010，4(4):441-443.

[14]賈 寧，閆中強(qiáng)，劉 剛，等.免疫滲濾與膠體金快速檢測(cè)在篩查甲型流感中診斷效率分析[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，30(10):2267-2269.

[15]魏 娟，陳杭薇，呂 楠，等.膠體金免疫層析法快速檢測(cè)甲型流感病毒的可行性[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33(2):113.

[16]Lee CS，Lee JH，Kim CH.Time-dependent sensitivity of a rapid antigen test in patients with 2009 H1N1 influenza[J].J Clin Microbiol，2011，49(4):1702.