健康成人血清鄰苯三酚法測(cè)定超氧化物歧化酶參考范圍的建立

武 強(qiáng)

(復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200240)

超氧化物歧化酶(SOD)是廣泛存在于生物體內(nèi)能清除超氧陰離子自由基的一類金屬酶，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展密不可分。SOD的測(cè)定方法有直接法和間接法。目前大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用間接法進(jìn)行活性檢測(cè)。鄰苯三酚法是間接法中的一種，是根據(jù)鄰苯三酚自氧化可產(chǎn)生強(qiáng)熒光的醌，SOD通過清除該反應(yīng)過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基()使醌減少而建立起來的動(dòng)力學(xué)方法，適用于各種自動(dòng)化分析儀。目前國內(nèi)對(duì)于該方法測(cè)定SOD的參考范圍少有報(bào)道。本研究旨在建立本地區(qū)血清鄰苯三酚法SOD參考范圍。

材料和方法

一、材料

1.儀器 ROCHE Modular 4P全自動(dòng)生化分析儀。

2.試劑 血清SOD試劑盒(批號(hào)110104-01)及配套校準(zhǔn)品(批號(hào):20110114)、質(zhì)控血清(批號(hào):高值20110104、低值20110104)由福建福緣生物科技有限公司提供。

二、方法

1.對(duì)象 2011年4月至7月在復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院健康體檢者(包括招工體檢、學(xué)生體檢、征兵體檢、職工體檢、退休人員體檢等，不包括正常妊娠婦女)，從中篩選出體檢結(jié)論正常者1640人(排除心腦血管疾病、高血壓、糖尿病、肝病、腎病、自身免疫及其他影響血清SOD水平的疾患)，其中男878名、女762名，年齡17～87歲。根據(jù)年齡分為5組:≤30歲組(男157名、女204名);31～歲組(男152名、女150名);41～歲組(男179名、女177名);51～歲組(男239名、女131名);＞60歲組(男151名、女100名)。

2.樣本收集、檢測(cè) 清晨空腹坐位采取靜脈血4 mL，1 h內(nèi)分離血清，4 h內(nèi)完成測(cè)定。

3.測(cè)定方法 鄰苯三酚法。在堿性工作液中，鄰苯三酚會(huì)產(chǎn)生自氧化顯色反應(yīng)，在其自氧化過程中不斷釋放出。當(dāng)SOD活性降低時(shí)，釋放發(fā)生歧化反應(yīng)被抑制濃度升高，從而抑制鄰苯三酚的自氧化，其顯色反應(yīng)強(qiáng)度減弱，即樣本中鄰苯三酚自氧化的顯色反應(yīng)強(qiáng)度與SOD的活性呈正相關(guān)關(guān)系。按試劑盒說明書設(shè)置儀器的測(cè)定參數(shù)。

4.SOD單位定義 在25℃恒溫條件下，每毫升反應(yīng)液中每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化率達(dá)50%的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

5.試劑盒性能 (1)精密度評(píng)價(jià):參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究協(xié)會(huì)(CLSI)EP5-A2文件，選擇低值和高值2個(gè)水平的質(zhì)控品2份，一份平行測(cè)定20次，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)(CV);一份連續(xù)檢測(cè)20 d，計(jì)算批間CV;(2)正確度評(píng)價(jià):選取2個(gè)水平質(zhì)控品(高值 200 U/mL;低值150 U/mL)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定5次取均值，計(jì)算測(cè)定結(jié)果與靶值的偏倚;(3)線性范圍評(píng)價(jià):參考 CLSI EP6-A2文件，選取高(H)、低(L)2個(gè)水平樣本，將H和L樣本按4L、3L+1H、2L+2H、1L+3H、4H比例得到系列評(píng)價(jià)樣本，每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定4次，將理論值與實(shí)測(cè)值用直線回歸進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用來表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，SOD與年齡的相關(guān)性分析采用pearson直線相關(guān)分析，男、女組不同年齡段之間采用方差分析，并進(jìn)一步采用SNK檢驗(yàn)進(jìn)行多組間均數(shù)的比較，同組男、女均數(shù)比較用t檢驗(yàn)法，總體參考范圍由±2s計(jì)算出。

結(jié) 果

一、試劑盒性能評(píng)價(jià)結(jié)果

1.精密度 高值和低值的批內(nèi)CV和批間CV分別為 0.94%、1.45%和 1.13%、1.69%。

2.正確度 高、低值2個(gè)水平質(zhì)控品測(cè)定結(jié)果與靶值偏倚分別為1.80%、2.27%。

3.線性范圍 實(shí)測(cè)值與理論值回歸方程為Y=0.9967X+1.9492，r=0.9999，實(shí)測(cè)線性范圍30～570 U/mL。試劑盒測(cè)定范圍15～400 U/mL。

二、血清SOD濃度與受檢者性別的關(guān)系

所有受檢者血清SOD濃度的分布經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，男、女性組血清SOD濃度分別為(170.0 ±23.4)U/mL 和(164.0 ±20.4)U/mL，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，結(jié)果見表1。

表1 1640名健康成人血清SOD濃度分析(，U/mL)

表1 1640名健康成人血清SOD濃度分析(，U/mL)

注:與同年齡組女性比較，*P＜0.01;與≤30歲組比較，#P ＜0.01;與31～歲組比較，ΔP ＜0.01;與41～ 歲組比較，▲P ＜0.01;與51～歲組比較，＆P ＜0.01

年齡(歲)男女例數(shù)SOD 例數(shù)SOD 204 174.8 ±15.931 ～ 152 181.8 ±18.0* 150 171.9 ±14.141 ～ 179 170.8 ±22.3*#Δ 177 160.8 ±14.2#Δ 51 ～ 239 168.7 ±15.6*#Δ 131 159.8 ±20.3#Δ＞60 151 144.5 ±23.2*#Δ▲＆ 100 141.5 ±23.0#Δ▲＆合計(jì) 878 170.0 ±23.4*≤30 157 184.2 ±17.4*762 164.0 ±20.4

三、血清SOD濃度與年齡之間的關(guān)系

血清SOD濃度與年齡呈負(fù)相關(guān)(r=－0.541，P ＜0.01)，見圖 1。在男、女 2 組 SOD濃度均隨年齡的增長(zhǎng)而降低。與≤30歲組比較，除31～歲組外，其余3組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。＞60歲組與41～歲及51～歲組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，且＞60歲組濃度變化最大，見表1。

圖1 健康成人血清SOD濃度與年齡的相關(guān)性

四、健康成人SOD參考范圍

根據(jù)以上分析將受檢者分為6組。男性:≤40歲組為147.6 ～218.4 U/mL，41 ～60 歲組為131.4～207.8 U/mL，＞60 歲組為 98.1 ～190.9 U/mL;女性:≤40歲組為142.0 ～205.2 U/mL，41 ～60 歲組為126.4～194.4 U/mL，＞60 歲組為 95.5 ～187.5 U/mL。

討 論

SOD是廣泛存在于生物體內(nèi)能清除超氧陰離子自由基的一類金屬酶，按所含金屬種類不同，人類SOD可分為3類:銅鋅SOD、錳SOD和胞外SOD[1]。本研究所測(cè)定的血清 SOD主要是分泌到胞外的SOD濃度[2]。SOD具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。SOD在生物體內(nèi)水平的高低可以間接反映體內(nèi)氧自由基水平。現(xiàn)已證實(shí)，人體利用的氧氣中有1% ～5%被轉(zhuǎn)化為氧自由基[3]，由氧自由基引發(fā)的疾病多達(dá)60多種。SOD是機(jī)體重要的氧自由基清除劑[4]，可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞。因此，在生物抗氧化機(jī)制中SOD的地位越來越重要，對(duì)輻射有防護(hù)作用，能減少糖尿病慢性并發(fā)癥及肺部疾病，其抗炎活性可減少缺血再灌注損傷，預(yù)防心血管疾病，還具有抗腫瘤、抗衰老等作用。

血清SOD濃度在不同性別之間有明顯差異，這有可能與個(gè)體的體型有關(guān)，與國外報(bào)道有所不同，可能與種族不同有關(guān)[5]。血清SOD與年齡呈負(fù)相關(guān)。在不同的年齡段其濃度有所變化，隨著年齡的增加(r= －0.541，P ＜0.01)，SOD 呈逐漸下降趨勢(shì)。因此，使機(jī)體細(xì)胞更易受到氧化劑的攻擊，而引起老化和疾病[6]，特別是一些與年齡相關(guān)的疾病。

本研究對(duì)象總體血清SOD濃度呈正態(tài)分布，參考范圍男性:≤40歲為147.6～218.4 U/mL、41～60歲為 131.4～207.8 U/mL、＞60歲為98.1 ～190.9 U/mL;女性:≤40 歲為 142.0 ～205.2 U/mL、41 ～60 歲為 126.4 ～194.4 U/mL、＞60歲為95.5 ～187.5 U/mL。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室所采用的檢測(cè)系統(tǒng)和所采用的方法建立本實(shí)驗(yàn)室參考范圍是非常必要的。鄰苯三酚法具有性能穩(wěn)定、精密度高、試劑簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，在臨床中應(yīng)用越來越廣泛。SOD測(cè)定雖然是一種非特異的輔助診斷指標(biāo)，但對(duì)機(jī)體自由基代謝紊亂、自由基清除干預(yù)對(duì)策以及對(duì)于同一病患者病程轉(zhuǎn)歸的判斷，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)具有重要參考價(jià)值。

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