梨成熟果實(shí)對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌抗擴(kuò)展能力的評(píng)價(jià)

趙 梅， 陶書(shū)田， 齊開(kāi)杰， 陳盛君， 張紹鈴

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)梨工程技術(shù)研究中心，南京 210095）

梨 炭 疽 病 （pear anthracnose）和輪紋 病 （pear ring rot）是梨樹(shù)兩大主要病害。梨炭疽病菌為半知菌亞門(mén)刺盤(pán)孢屬的膠孢炭疽菌［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.］［1］，主要危害果實(shí)，使果實(shí)腐爛、早落、影響產(chǎn)量和品質(zhì)。梨輪紋病菌為子囊菌亞門(mén)葡萄座腔菌屬的梨生孢囊殼菌（Botryosphaeria berengeriana de Not.）［2］，主要危害枝干和果實(shí)，葉片受害比較少見(jiàn)。梨輪紋病除危害梨，還可危害蘋(píng)果、山楂、桃等果樹(shù)。培育和利用抗病品種是防治病害的最有效、最符合農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展要求的措施，因此鑒定梨品種對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌的抗性是抗病育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前，不同梨品種果實(shí)對(duì)炭疽病菌抗性的評(píng)價(jià)還未見(jiàn)報(bào)道，而對(duì)輪紋病菌抗性的評(píng)價(jià)雖有部分報(bào)道［3－5］，但所試驗(yàn)品種有限。病原菌在寄主體內(nèi)擴(kuò)展是導(dǎo)致其發(fā)病的重要階段之一，因此研究寄主抗病原菌擴(kuò)展能力對(duì)于評(píng)價(jià)其抗病性具有較好的指導(dǎo)意義。本研究對(duì)101份梨種質(zhì)資源的成熟果實(shí)進(jìn)行室內(nèi)接種梨炭疽病菌和輪紋病菌，測(cè)定各梨品種果實(shí)對(duì)兩種病菌的抗擴(kuò)展能力。本研究首次利用聚類(lèi)分析方法對(duì)梨成熟果實(shí)抗炭疽病菌和輪紋病菌擴(kuò)展能力分類(lèi)，該分類(lèi)方法比較靈活，可以根據(jù)研究目的及研究對(duì)象而調(diào)整，使分類(lèi)在定量和定性方面得到統(tǒng)一。同時(shí)，對(duì)梨果實(shí)抗病菌擴(kuò)展能力及果實(shí)主要生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。本研究不僅為梨優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)技術(shù)提供理論支撐，還可為梨種質(zhì)資源評(píng)價(jià)、篩選及抗性育種提供重要理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年7月－10月，以南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江浦梨資源圃的101個(gè)梨品種果實(shí)為試材。梨炭疽病菌和輪紋病菌由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院劉鳳權(quán)課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

于各品種的成熟期采摘梨果實(shí)，不同梨品種成熟期的確定參考各品種往年成熟期和種子顏色變成褐色且果實(shí)組織沒(méi)有衰老。每個(gè)品種選取長(zhǎng)勢(shì)中等、產(chǎn)量一致的5株樹(shù)，在每株樹(shù)冠外圍不同方向隨機(jī)選取5個(gè)大小一致、無(wú)病蟲(chóng)害果實(shí)，每個(gè)品種共計(jì)25個(gè)果實(shí)。10個(gè)果實(shí)用于接種炭疽病菌，10個(gè)果實(shí)用于接種輪紋病菌，5個(gè)果實(shí)用于測(cè)定該品種主要生理指標(biāo)。

1.2.2 接種方法

取生長(zhǎng)均一的梨炭疽病菌及輪紋病菌菌絲培養(yǎng)物，連同培養(yǎng)基用直徑5mm打孔器采下菌餅。用酒精棉（75%乙醇浸泡）對(duì)梨表面進(jìn)行消毒處理，在每個(gè)梨果實(shí)中偏上部針刺接種菌餅，每果接種2個(gè)菌餅，封口膜密封固定。接種后的果實(shí)置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)6d，測(cè)量病斑直徑。病斑直徑越大，表明梨品種對(duì)病菌抗擴(kuò)展能力越小。

1.2.3 果實(shí)主要生理指標(biāo)測(cè)定

總酚含量的測(cè)定采用福林酚法［6］，以沒(méi)食子酸為基準(zhǔn)物質(zhì)，計(jì)算梨果肉多酚含量。石細(xì)胞含量測(cè)定參照聶繼云等［7］的冷凍分離法進(jìn)行。木質(zhì)素含量測(cè)定參照Sancho等［8］的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。依據(jù)病斑直徑，運(yùn)用歐氏最長(zhǎng)距離法，對(duì)101個(gè)梨品種進(jìn)行聚類(lèi)分析。同時(shí)，對(duì)梨果實(shí)炭疽病病斑直徑、輪紋病病斑直徑與梨果肉總酚、石細(xì)胞以及木質(zhì)素含量作相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同梨品種果實(shí)對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌抗擴(kuò)展能力及其生理指標(biāo)變化特點(diǎn)

101個(gè)梨品種果實(shí)炭疽病病斑直徑和輪紋病病斑直徑及其生理指標(biāo)見(jiàn)表1。從表1可以看出：不同梨品種感病（炭疽病和輪紋?。┖蟮牟“咧睆讲町愝^大。其中，炭疽病病斑直徑為0.6～4.0cm，均值為2.4cm；輪紋病病斑直徑為1.8～6.7cm，均值為3.9cm。由此可知，總體上，輪紋病病斑直徑平均比炭疽病病斑直徑大，即梨種質(zhì)資源對(duì)輪紋病菌的抗擴(kuò)展能力低于對(duì)炭疽病菌的抗擴(kuò)展能力。在所有供試?yán)嫫贩N果實(shí)中，‘巴梨’總酚含量最高，為0.859A／g，‘秋榮’總酚含量最低，為0.163A／g，101個(gè)梨品種果實(shí)總酚含量均值是0.323A／g；石細(xì)胞含量差異很大，含量變化范圍在0.010～1.036g／100g，均值為0.233g／100g，大部分品種集中在0.1～0.65g／100g，占所有品種的77.8%，只有2個(gè)品種大于0.65g／100g，分別為‘白皮酥’和‘金川野生梨2號(hào)’；木質(zhì)素含量變化范圍為0.140～0.547A／10g，均值為0.303A／10g。

表1 炭疽病病斑直徑、輪紋病病斑直徑及其主要生理指標(biāo)Table 1 The main physiological factors of fruits and lesion diameters of fruit anthracnose and ring rot

續(xù)表1 Table1（Continued）

續(xù)表1 Table1（Continued）

2.2 不同梨品種果實(shí)對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌的抗擴(kuò)展能力的聚類(lèi)分析

根據(jù)101個(gè)梨品種果實(shí)炭疽病病斑直徑的差異，進(jìn)行不同梨品種果實(shí)對(duì)炭疽病菌抗擴(kuò)展能力分類(lèi)。以最長(zhǎng)距離法λ＝7.0，可以將101個(gè)品種劃分為5類(lèi)，其結(jié)果繪成譜系（圖1）。

圖1 101個(gè)梨品種果實(shí)對(duì)炭疽病菌抗擴(kuò)展能力聚類(lèi)分析圖Fig.1 Cluster analysis of anti－expansion capacity against the pathogens of anthracnose in fruits of 101 Pyrus species

其中第一類(lèi)抗擴(kuò)展性強(qiáng)，病斑直徑為0.638～1.537cm，有14個(gè)品種，占測(cè)定品種的13.9%；第二類(lèi)抗擴(kuò)展性較強(qiáng)，病斑直徑為1.645～2.153cm，有23個(gè)品種，占測(cè)定品種的22.8%；第三類(lèi)抗擴(kuò)展性中等，病斑直徑為2.197～2.879cm，有41個(gè)品種，占測(cè)定品種的40.6%；第四類(lèi)抗擴(kuò)展性較弱，病斑直徑為2.962～3.448cm，有17個(gè)品種，占測(cè)定品種的16.8%；第五類(lèi)是抗擴(kuò)展性弱，病斑直徑為3.544～3.974cm，只有6個(gè)品種，占測(cè)定品種的5.9%。

以上述梨果實(shí)對(duì)炭疽病菌抗擴(kuò)展能力的評(píng)價(jià)方法，進(jìn)行梨果實(shí)對(duì)輪紋病菌抗擴(kuò)展能力的聚類(lèi)分析，101個(gè)品種也劃分為5類(lèi)，其結(jié)果繪成譜系（圖2）。其中第一類(lèi)抗擴(kuò)展性強(qiáng)，病斑直徑為1.856～2.755cm，有22個(gè)品種，占測(cè)定品種的21.8%；第二類(lèi)抗擴(kuò)展性較強(qiáng)，病斑直徑為2.896～3.481cm，有17個(gè)品種，占測(cè)定品種的16.8%；第三類(lèi)抗擴(kuò)展性中等，病斑直徑為3.578～4.550cm，有36個(gè)品種，占測(cè)定品種的35.6%；第四類(lèi)抗擴(kuò)展性較弱，病斑直徑為4.689～5.996cm，有24個(gè)品種，占測(cè)定品種的23.8%；第五類(lèi)抗擴(kuò)展性弱，病斑直徑為6.714～6.720cm，僅有2個(gè)品種，占測(cè)定品種的2.0%。

圖2 101個(gè)梨品種果實(shí)對(duì)輪紋病菌抗擴(kuò)展能力聚類(lèi)分析圖Fig.2 Cluster analysis of anti－expansion capacity against the pathogens of ring rot in fruits of 101 Pyrus species

聚類(lèi)分析結(jié)果表明，對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌抗擴(kuò)展能力均為中等的梨品種最多，而對(duì)上述兩種病菌表現(xiàn)為抗擴(kuò)展性弱的品種最少。

2.3 梨果實(shí)對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌的抗擴(kuò)展能力與其主要生理指標(biāo)相關(guān)性分析

對(duì)梨果實(shí)炭疽病病斑直徑、輪紋病病斑直徑與梨果肉總酚、石細(xì)胞以及木質(zhì)素含量作相關(guān)性分析（表2），結(jié)果表明，炭疽病病斑直徑和輪紋病病斑直徑呈極顯著正相關(guān)（R＝0.687＊＊），可見(jiàn)不同品種梨果對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌抗擴(kuò)展能力呈極顯著正相關(guān)；果肉總酚含量與炭疽病病斑直徑呈極顯著負(fù)相關(guān)，與輪紋病菌病斑直徑呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明梨果肉總酚含量與果實(shí)對(duì)炭疽病菌抗擴(kuò)展能力呈極顯著正相關(guān)，與果實(shí)對(duì)輪紋病菌抗擴(kuò)展能力呈顯著正相關(guān)；果肉石細(xì)胞含量和上述兩種病害的病斑直徑均呈負(fù)相關(guān)，其中與輪紋病病斑直徑達(dá)到極顯著水平，表明果肉石細(xì)胞含量和梨果實(shí)對(duì)炭疽病菌抗擴(kuò)展能力呈正相關(guān)，和梨果實(shí)對(duì)輪紋病菌抗擴(kuò)展能力呈極顯著正相關(guān)；而果肉木質(zhì)素含量和這兩種病害的病斑直徑相關(guān)性不明顯，說(shuō)明果肉木質(zhì)素含量和梨果實(shí)對(duì)這兩種病菌的抗擴(kuò)展能力相關(guān)性均不明顯。

表2 炭疽病病斑直徑、輪紋病病斑直徑與其生理指標(biāo)相關(guān)性分析Table 2 Relative analysis of the lesion diameters of fruit anthracnose and ring rot and main physiological factors in pear fruits

3 討論

梨炭疽病和輪紋病是梨樹(shù)兩大主要病害，是成熟期和貯藏期導(dǎo)致果實(shí)腐爛的重要原因［2－3］。為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)梨果，選擇栽培抗病品種是最經(jīng)濟(jì)、有效的措施。不同寄主對(duì)病原菌的抗擴(kuò)展能力對(duì)研究不同寄主對(duì)病原菌的抗性具有重要的指導(dǎo)意義。本研究對(duì)101個(gè)梨品種分別進(jìn)行室內(nèi)接種炭疽病和輪紋病，并通過(guò)聚類(lèi)分析及相關(guān)分析等方法進(jìn)行供試品種對(duì)兩種病菌的抗擴(kuò)展能力的評(píng)價(jià)和鑒定。結(jié)果表明，不同梨品種對(duì)兩種病菌的抗擴(kuò)展能力差異較大，總體上所測(cè)試的梨品種對(duì)輪紋病菌抗擴(kuò)展能力低于對(duì)炭疽病菌的抗擴(kuò)展能力。

本研究采用室內(nèi)人工接種果實(shí)的方法進(jìn)行梨品種果實(shí)對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌抗擴(kuò)展能力的評(píng)價(jià)，可以減少外界不確定性因素干擾以及進(jìn)行果實(shí)套袋或菌體保濕等工作的人力和資源耗費(fèi)［9］。但其結(jié)果是否與田間自然抗性鑒定結(jié)果具有很好的正相關(guān)，以及是否以室內(nèi)人工接種鑒定更為準(zhǔn)確，還有待進(jìn)一步研究。

本研究首次采用聚類(lèi)分析方法進(jìn)行不同梨品種對(duì)病菌抗擴(kuò)展能力的研究。聚類(lèi)分析的功能是建立一種分類(lèi)方法，它將一批樣品或變量按照它們?cè)谛再|(zhì)上親疏程度進(jìn)行分類(lèi)［10］。將供試品種劃為若干類(lèi)群，類(lèi)群內(nèi)具有相似的抗性反應(yīng)組合，而類(lèi)群間具有較明顯的抗性反應(yīng)差異。在本研究中，根據(jù)最長(zhǎng)距離法（λ＝7.0），101個(gè)梨品種對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌的抗擴(kuò)展能力均可分為5類(lèi)，即抗擴(kuò)展性強(qiáng)、較強(qiáng)、中等、較弱、弱。不同梨品種果實(shí)對(duì)炭疽病菌抗擴(kuò)展能力聚類(lèi)分析結(jié)果表明，抗擴(kuò)展性強(qiáng)的品種14個(gè)、抗擴(kuò)展性較強(qiáng)的品種23個(gè)、抗擴(kuò)展性中等的品種41個(gè)、抗擴(kuò)展性較弱的品種17個(gè)、抗擴(kuò)展性弱的品種6個(gè)，分別占供試品種的13.9%、22.8%、40.6%、16.8%、5.9%。梨果實(shí)對(duì)輪紋病菌抗擴(kuò)展能力分類(lèi)結(jié)果表明，抗擴(kuò)展性強(qiáng)的品種22個(gè)，抗擴(kuò)展性較強(qiáng)的品種17個(gè)，抗擴(kuò)展性中等的品種36個(gè)，抗擴(kuò)展性較弱的品種24個(gè)，抗擴(kuò)展性弱的品種2個(gè)，分別占測(cè)定品種的21.8%、16.8%、35.6%、23.8%、2.0%。結(jié)果分析表明，在101個(gè)供試?yán)嫫贩N中，對(duì)上述兩種病菌抗擴(kuò)展能力均為中等的品種所占比率最多，而對(duì)上述兩種病菌表現(xiàn)為抗擴(kuò)展性弱的品種所占比率最少。

酚類(lèi)物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的次生代謝物質(zhì)，其與植物抗病性密切相關(guān)［11］。植物積累酚類(lèi)物質(zhì)的來(lái)源主要有兩個(gè)，一是寄主品種原始酚類(lèi)物質(zhì)的積累，二是在病原菌侵染后，宿主細(xì)胞迅速作出反應(yīng)，酚類(lèi)物質(zhì)迅速積累［12］。劉海英等［13］對(duì)蘋(píng)果成熟期果實(shí)進(jìn)行輪紋病菌的接種，研究結(jié)果表明蘋(píng)果果實(shí)總酚含量是果實(shí)輪紋病發(fā)病的負(fù)相關(guān)因子。本研究發(fā)現(xiàn)，梨果肉中總酚含量與梨果實(shí)對(duì)炭疽病菌抗擴(kuò)展能力呈極顯著正相關(guān)，與梨果實(shí)對(duì)輪紋病菌抗擴(kuò)展能力呈顯著正相關(guān)，研究結(jié)果與劉海英等［13］的結(jié)果較為一致。木質(zhì)素是高等植物重要的結(jié)構(gòu)物質(zhì)，木質(zhì)素的累積是抗病菌侵入的主要因素［11］。但本研究結(jié)果顯示，梨果肉木質(zhì)素含量與梨果實(shí)對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌抗擴(kuò)展能力相關(guān)性不明顯，但是果肉中石細(xì)胞的含量與梨果實(shí)對(duì)炭疽病菌和輪紋病菌抗擴(kuò)展能力呈正相關(guān)，其中與梨果實(shí)對(duì)輪紋病菌抗擴(kuò)展能力相關(guān)性達(dá)到極顯著水平。木質(zhì)素是石細(xì)胞的主要成分，Ranadive等［14］發(fā)現(xiàn)‘Yuzuhada’梨果實(shí)石細(xì)胞中含有18%的木質(zhì)素，而Tao等［15］報(bào)道‘碭山酥梨’石細(xì)胞中木質(zhì)素含量高達(dá)30%。在本研究中，石細(xì)胞與果實(shí)對(duì)病菌抗擴(kuò)展能力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，是否主要是由于木質(zhì)素的作用，還有待于進(jìn)一步研究。

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