甲型H1N1(2009)流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的建立與評(píng)價(jià)

秦智鋒，張彩虹，孫 潔，劉建利，盧體康，阮周曦，林慶燕，呂建強(qiáng)，曹琛福，曾少靈，陳書琨，廖立珊，花群義

(1.深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東深圳518001；2.深圳市檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，廣東深圳518001；3.深圳市外來(lái)有害生物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳518045)

在甲型流感病毒H1N1(2009)暴發(fā)流行期間，許多國(guó)家均有人源病毒感染豬的報(bào)道[1]。甲型H1N1(2009)病毒在豬體內(nèi)可以發(fā)生變異和重組，進(jìn)而產(chǎn)生具有潛在危害的新毒株。加強(qiáng)豬群中豬流感病毒(Sw ine influenza virus，SIV)、尤 其是 甲 型 H1N1(2009)流感病毒(Pandemic H1N12009)的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)顯得非常迫切。WHO、OIE和FAO聯(lián)合要求對(duì)豬群中甲型H1N1(2009)流感病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并能夠與其他病毒株進(jìn)行鑒別，以評(píng)估甲型H1N1(2009)病毒株與其他病毒株重組的風(fēng)險(xiǎn)[1]。

WHO連續(xù)推出多個(gè)流感參考實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)RT-PCR檢測(cè)方法和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法等系列SIV的分子生物學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[2]，包括美國(guó)疾病控制中心(CDC)推薦的A型流感病毒、SIV、H1亞型SIV的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR(Real time RT-PCR，rRT-PCR)檢測(cè)方法。盡管豬流感不是OIE必須呈報(bào)的重大動(dòng)物疫病，OIE也在2009年專門重新制訂了SIV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[3]，但其中缺少詳細(xì)的快速分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)。美國(guó)農(nóng)業(yè)部(USDA)也推薦了一種甲型H1N1(2009)[pH1N1(2009)]流感病毒實(shí)時(shí)熒RT-PCR檢測(cè)方法[4]。

實(shí)際應(yīng)用表明，美國(guó)CDC推薦的rRT-PCR方法存在特異性低的問(wèn)題。USDA推薦的檢測(cè)方法具有較高的特異性，但靈敏度較低。因此，本研究在USDA推薦的引物和探針基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)了探針和其他改進(jìn)，建立特異性快速檢測(cè)甲型H1N1(2009)流感病毒的rRT-PCR方法[rRT-PCR for Pandem ic H1N1(2009)，pH1N1(2009)-rRT-PCR]，并在大量田間樣本中進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 病毒株 甲型H1N1流感裂解疫苗A/California/7/2009NYMC X-179A購(gòu)自北京科興生物制品有限公司；A/Human/shenzhen/0716/2009(H1N1)、A/Human/shenzhen/0804/2009(H1N1)由疾病控制中心惠贈(zèng)；A/Human/shenzhen/02/2009(H1N1)和 A/Human/shenzhen/03/2009(H1N1)均由深圳兒童醫(yī)院分離、鑒定；A/Sw ine/huanan/szciq-1/2006(H1N1)和 A/Sw ine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)均由深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定；A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)(禽流感病毒(AIV)H5亞型HI檢測(cè)抗原)由香港實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；AIV H5、H7和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原均購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試驗(yàn)試劑及儀器 一步法rRT-PCR試劑盒(AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit)購(gòu)自ABI公司；病毒核酸抽提試劑盒(Qiagen Viral RNA Mini Kit)購(gòu)自Qiagen公司；USDA推薦的甲型H1N1(2009)(pH1N1-2009)流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)引物探針[5]均由上?；倒竞铣?。

1.3 引物與探針的設(shè)計(jì) 引物與探針的設(shè)計(jì)參考USDA推薦的甲型H1N1(2009)(pH1N1(2009))流感病毒rRT-PCR檢測(cè)的引物和探針。參照Bao等流感序列分析方法[5]，對(duì)甲型H1N1(2009)流感病毒序列與GenBank中登錄的經(jīng)典型H1N1SIV、人季節(jié)性流感H1N1病毒不同年代、不同國(guó)家地區(qū)、不同宿主的NA基因進(jìn)行序列比對(duì)分析。以Clustal方式進(jìn)行比對(duì)，以NA基因中最保守的20個(gè)寡核苷酸序列作為探針，在探針兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的上下游引物，并在反轉(zhuǎn)錄引物處設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，以避免漏檢。上游引物FP：5'-CAACACCAACTTTGCTGC-3'，反轉(zhuǎn)錄引物RP：5'-GGAACCGATTCTTA(C/T)ACT GTTGTC-3'， 探 針 Pb： 5'-FAM-CAGTCAGTGGTTT CCGTGAAATTAGC-BHQ-3'。

1.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法(rRT-PCR)的建立 參照QIAamp Viral RNA M ini Kit操作說(shuō)明書，于全自動(dòng)核酸抽提工作站中抽提A/California/7/2009NYMC X-179A、A/Human/shenzhen/0716/2009(H1N1)、A/Human/shenzhen/0804/2009(H1N1)、 A/Human/shenzhen/02/2009(H1N1)、A/Human/shenzhen/03/2009(H1N1)、 A/Sw ine/huanan/szciq-1/2006(H1N1)、A/Sw ine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)、A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)和AIV H5、H7和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)HI檢測(cè)抗原等11株流感病毒的與陰性對(duì)照雞胚尿囊液中的核酸。

參照AgPath-IDTMOne-Step RT-PCR Kit操作說(shuō)明書配制熒光RT-PCR反應(yīng)體系：2×RT-PCR 12.5μL、酶混合物1μL、10μM 的pH1N1(2009)-FP 1μL和pH1N1(2009)-RP各 1μL、5μM pH1N1(2009)-Pb 1μL、無(wú)核酸酶的水2.5μL、RNA模板5μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃30m in；95℃10m in；95℃ 10s、60℃ 30s，40個(gè)循環(huán)；設(shè)置60℃ 時(shí)收集熒光信號(hào)。

1.55 種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度比較選取A/California/7/2009NYMC X-179A裂解疫苗株作為靈敏度的研究對(duì)象，該病毒株的HA滴度為1∶640，雞胚半數(shù)致死量為108.5EID50/m L。以無(wú)核酸酶的水10倍系列稀釋成1×10-1～1×10-10，采用EZ1抽提核酸。按照WHO推薦美國(guó)CDC建立的檢測(cè)方法和美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的檢測(cè)方法，與本研究建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR方法進(jìn)行靈敏度檢測(cè)比較，確定所建立方法的靈敏度。

1.65 種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法特異性比較采用建立pH1N1(2009)-rRT-PCR方法對(duì)11株流感病毒株進(jìn)行檢測(cè)，確定本研究建立的檢測(cè)方法與經(jīng)典型SIV H1N1及其他亞型之間的交叉反應(yīng)。采用本研究建立的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的雞肉正常組織、雞血清、火雞肌肉組織、鴿組織、豬肉組織、豬血清、正常雞胚尿囊液、其他家禽病毒和細(xì)菌共16份非流感毒株樣品進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步確定所建立方法的特異性。

采用抽提的核酸，同時(shí)評(píng)估WHO推薦的美國(guó)CDC建立的 CDC-InfA-rRT-PCR、CDC-SW-InfA-rRT-PCR、CDC-SW-H1-rRT-PCR和 USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.7 pH1N1(2009)-rRT-PCR重復(fù)性試驗(yàn) 將建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR方法組裝成試劑盒，測(cè)定其穩(wěn)定性。對(duì)A/California/7/2009NYMC X-179A裂解疫苗株原液進(jìn)行10-4、10-5和10-6稀釋后，分別抽提核酸，進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，確定所建立方法的組內(nèi)差異。將3個(gè)梯度抽提的核酸，分別用保存1周、1個(gè)月和3個(gè)月的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，確定組間差異。

1.8 深港實(shí)驗(yàn)室之間的比對(duì) 為了進(jìn)一步確證所建立pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和可靠性，將A/Human/shenzhen/0716/2009(H1N1)、A/Sw ine/huanan/szciq-1/2006(H1N1)、A/Sw ine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)株和本研究建立方法的相關(guān)試劑，在香港與獸醫(yī)化驗(yàn)所進(jìn)行檢測(cè)方法比較。其中香港提供了3株病毒(2株為經(jīng)典型豬流感H1N1、1株為香港分離的甲型H1N1流感病毒株)。

1.9 田間試驗(yàn) 自2009年5月份開始，從大型豬場(chǎng)和養(yǎng)禽場(chǎng)采集樣品進(jìn)行甲型H1N1流感病毒的監(jiān)測(cè)。按照CDC-InfA-rRT-PCR方法進(jìn)行流感病毒的篩選檢測(cè)，如果檢出陽(yáng)性樣品，再按CDC-SW-H1-rRT-PCR和pH1N1(2009)-rRT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 rRT-PCR的建立 以設(shè)定的反應(yīng)條件，于熒光PCR儀上進(jìn)行pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)。在陰性對(duì)照成立的情況下，5株甲型H1N1(2009)流感病毒株出現(xiàn)特異性實(shí)時(shí)擴(kuò)增，AIV和SIV均沒(méi)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增，相互之間無(wú)相關(guān)交叉反應(yīng)(圖1)。

2.25 種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 將10倍系列稀釋的A/California/7/2009NYMCX-179A的RNA同時(shí)進(jìn)行CDC-InfA-rRT-PCR、CDC-SW-InfA-rRT-PCR、CDC-SW-H1-rRT-PCR、USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR和pH1N1(2009)-rRT-PCR靈敏度測(cè)定。結(jié)果顯示，所建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度為 10-6，即4.51EID50(圖 2)。 CDC-InfA-rRT-PCR(圖 3)、 CDC-SW-InfA-rRT-PCR(圖略)和 CDC-SW-H1-rRT-PCR(圖略)的靈敏度為10-6，即4.51EID50。美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度為10-5， 即 45.1EID50(圖 4)。pH1N1(2009)靈 敏 度 與CDC-InfA-rRT-PCR的靈敏度相當(dāng)，比USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR靈敏度高10倍，并且熒光增幅也較高。所建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)5株甲型H1N1(2009)流感病毒的靈敏度為100%(5/5)，無(wú)漏檢現(xiàn)象。

2.35 種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)11株流感病毒株進(jìn)行特異性檢測(cè)，5株甲型H1N1(2009)流感病毒株結(jié)果為陽(yáng)性，其他6株非甲型H1N1(2009)流感病毒株均無(wú)擴(kuò)增結(jié)果。表明本研究建立的方法特異性強(qiáng)，在流感病毒亞型之間無(wú)交叉反應(yīng)(圖1)。通過(guò)對(duì)16份非流感病毒株陽(yáng)性樣品的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性(圖略)，表明本研究建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法的特異性為100%(27/27)。表明該方法特異性強(qiáng)，與其他檢測(cè)對(duì)象無(wú)交叉反應(yīng)。

針對(duì)所有亞型的流感病毒，通用型檢測(cè)方法CDC-InfA-rRT-PCR特異性較好，能夠全部擴(kuò)增出11株流感病毒株，與其他非流感病毒株的16份核酸樣品無(wú)交叉。CDC-SW-InfA-rRT-PCR主要是用來(lái)檢測(cè)SIV，但試驗(yàn)表明，該方法不但可以檢測(cè)出SIV A/Sw ine/huanan/szciq-1/2006(H1N1)，而且能夠檢測(cè)出 AIV A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)和 AIV H5、H7和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)抗原，但卻不能檢測(cè)出SIV A/Sw ine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)。CDC-SW-H1-rRT-PCR可以特異性檢測(cè)所有經(jīng)典型的H1N1流感和甲型H1N1(2009)流感病毒，但不能將兩者區(qū)分開來(lái)。USDA-pH1N1(2009)-rRT-PCR特異性較差，在檢測(cè)A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)株時(shí)有微弱的擴(kuò)增信號(hào)(圖 5)。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 采用本研究組裝的pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)試劑盒測(cè)定A/California/7/2009NYMC X-179A裂解疫苗株10-4、10-5和10-63個(gè)稀釋度的組內(nèi)變異系數(shù)CV≤0.45%，符合檢測(cè)試劑盒的要求。不同時(shí)期組裝的試劑盒測(cè)定3個(gè)稀釋度后的組間差異系數(shù)為1.89%～3.72%，初步將檢測(cè)試劑盒的有效期定為6個(gè)月(表1)。

表1 pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)試劑盒的組內(nèi)和組間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1Intra-assay and inter-assay reproducibility test of the pH1N1(2009)-rRT-PCR kit

2.5 深港實(shí)驗(yàn)室之間的比較 本研究建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法與香港實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)行6株流感病毒株的檢測(cè)，可以特異性地檢測(cè)出兩株甲型H1N1(2009)流感病毒株。檢測(cè)香港甲型H1N1(2009)分離株的靈敏度為10-6。所建立的方法與香港采用的方法特異性和靈敏度一致，但擴(kuò)增效率明顯高于香港方法(圖略)。

2.6 田間試驗(yàn) 采集2009年～2011年注冊(cè)豬場(chǎng)和注冊(cè)禽場(chǎng)近3800份混合棉拭子樣品進(jìn)行3種rRT-PCR檢測(cè)。其中CDC-InfA-rRT-PCR和CDCSW-H1-rRT-PCR兩種方法共篩選出23例陽(yáng)性樣本，但經(jīng)pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)全部為陰性。挑選其中8例樣本送至國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行亞型確定，檢測(cè)結(jié)果全部為經(jīng)典型豬流感H1N1，而未檢測(cè)到甲型H1N1(2009)流感病毒。pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法與國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果一致。

3 討論

甲型H1N1(2009)流感病毒在許多洲的豬群中均有檢出，同時(shí)也進(jìn)行了人工感染和傳播試驗(yàn)[1]。目前沒(méi)有證據(jù)表明豬在甲型H1N1(2009)流感病毒的流行病學(xué)中具有重要的作用。但香港已經(jīng)發(fā)現(xiàn)甲型H1N1(2009)流感病毒已經(jīng)開始與一些經(jīng)典型的H1N1流感病毒和其他亞型發(fā)生重組，可能導(dǎo)致新的高傳播性病毒株出現(xiàn)。因此，對(duì)豬群中的甲型H1N1(2009)流感病毒進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查和普查監(jiān)測(cè)尤為迫切。鑒于SIV的危害性，WHO、FAO和OIE均加大了對(duì)SIV的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)。世界各國(guó)對(duì)動(dòng)物及動(dòng)物進(jìn)出口產(chǎn)品貿(mào)易中甲型H1N1(2009)流感病毒實(shí)施嚴(yán)格的控制和檢疫。

實(shí)時(shí)熒光PCR由于具有靈敏、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)而被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于臨床診斷[6-7]。WHO在2009年4月甲型H1N1(2009)流感病毒株暴發(fā)流行期間，將CDC所建立的甲型H1N1(2009)流感病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法作為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。但本研究在對(duì)WHO推薦的方法進(jìn)行評(píng)估過(guò)程中表明，這些檢測(cè)方法的特異性存在問(wèn)題，不能對(duì)甲型H1N1(2009)流感病毒和經(jīng)典型SIV H1N1病毒進(jìn)行區(qū)分。美國(guó)CDC建立的特異性檢測(cè)SIV的CDC-SW-InfA-rRT-PCR檢測(cè)方法，在檢測(cè)H1N1亞型SIV和AIV樣品時(shí)也表現(xiàn)出陽(yáng)性結(jié)果，并且對(duì)于A/Swine/huanan/szciq-2/2006(H3N2)非H1N1亞型病毒株出現(xiàn)漏檢。美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的USDA-pH1N1(2009)-rRTPCR檢測(cè)方法可以區(qū)分經(jīng)典型SIV H1N1和甲型H1N1(2009)流感病毒，但檢測(cè)靈敏度較低(10-5)，并且對(duì)檢測(cè)A/Chicken/HK/HI/1997(H5N1)株有微弱非特異性反應(yīng)。Blast分析表明，其探針位點(diǎn)有4個(gè)堿基缺失。根據(jù)理論推算，探針中每一個(gè)堿基的錯(cuò)配可導(dǎo)致降低約一個(gè)Ct值[8]。另外其上游引物也出現(xiàn)了一個(gè)堿基的錯(cuò)配和一個(gè)堿基的缺失。本研究在美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦的引物和探針基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)了探針，確保100%相符率，并且在反轉(zhuǎn)錄引物處設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，以避免漏檢[9-10]。在擴(kuò)增反應(yīng)中提高了退火溫度，以確保檢測(cè)方法的特異性[11]。

本研究建立的pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)甲型H1N1流感裂解疫苗的靈敏度可以達(dá)到10-6，與WHO推薦的A型流感病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度相同，而高于美國(guó)農(nóng)業(yè)部推薦方法的檢測(cè)靈敏度(10-5)。pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法與經(jīng)典型H1N1和其他亞型流感病毒株無(wú)任何交叉反應(yīng)，可以有效區(qū)分經(jīng)典型SIV H1N1和甲型H1N1(2009)流感病毒，保證了檢測(cè)的特異性。與香港獸醫(yī)化驗(yàn)所進(jìn)行了檢測(cè)比較，檢測(cè)靈敏度和特異性完全一致。田間試驗(yàn)對(duì)3800份豬和禽類樣品進(jìn)行檢測(cè)，CDC-InfA-rRT-PCR和CDC-SW-H1-rRTPCR方法檢測(cè)到的23份陽(yáng)性樣品，經(jīng)pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)均為陰性。抽樣送國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也均為陰性，證實(shí)了pH1N1(2009)-rRT-PCR檢測(cè)方法的在田間試驗(yàn)中具有較高的特異性。本研究建立的檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好，適合于甲型H1N1流感病毒的分子生物學(xué)檢測(cè)和田間樣品的大規(guī)模普查監(jiān)測(cè)。

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