甲型H1N1流感病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立

尹 航，楊煥良，陳 艷，孟沙沙，劉麗萍，辛?xí)怨?，陳化蘭，喬傳玲*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物流感重點開放實驗室/獸醫(yī)生物國家重點開放實驗室，黑龍江哈爾濱150001；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150030)

豬流感(Sw ine influenza，SI)是由SI病毒(SIV)引起的一種急性高度接觸傳染性呼吸道疾病。豬被認(rèn)為是流感病毒的“混合器”，它能夠促進(jìn)禽、豬和人流感病毒的重組，并產(chǎn)生可能引起在人群中大流行的新型病毒株[1]。不同亞型的SIV感染人事件時有發(fā)生。2009年爆發(fā)的甲型H1N1流感病毒中，SIV提供了多個基因片段[2]。近年來在我國分離的SIV主要包括：經(jīng)典型(CS)H1N1、北美三源重組型(TR)H1N2、歐洲類禽(EA)型H1N1流感病毒。國內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查顯示甲型H1N1流感病毒(pdm/09)在豬體內(nèi)已經(jīng)適應(yīng)和流行[3-4]，鑒于豬在流感病毒種間傳播中的作用，控制豬群感染甲型H1N1流感病毒的數(shù)量，是降低人感染甲型H1N1流感病毒風(fēng)險最重要的措施之一，而敏感特異的快速診斷方法是實現(xiàn)這一目標(biāo)的重要手段。實時熒光定量 PCR技術(shù)(Real-time fluorescent quantitative PCR，RF-PCR)以其特異性強、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點，在病原的定性定量檢測、基因表達(dá)水平分析等方面得到了廣泛應(yīng)用[5]。國外已經(jīng)開展了RF-PCR檢測甲型H1N1方法的研究[6-9]，但其流行病學(xué)研究背景與我國有很大不同，國外建立的方法并不能完全適應(yīng)我國豬群中甲型H1N1流感病毒的檢測。因此，建立適合我國SIV流行狀況，快速敏感檢測甲型H1N1流感病毒的RF-PCR方法，以區(qū)別于其他亞型SIV，對于SI的控制及人類公共衛(wèi)生方面具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 病毒株、質(zhì)粒和病料 甲型H1N1、古典型豬H1N1、 類 禽 型 H1N1、 類 人 型 H1N1、 H1N2、H3N2、H5N1和H9N2流感病毒由本實驗室分離、鑒定并保存；甲型H1N1流感病毒HA基因重組質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建并保存；鼻拭子采集自廣西、天津、廣東、黑龍江省不同地區(qū)的豬場。

1.2 主要試劑和儀器 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNase out購自Invitrogen公司；dNTP、pMD18-T載體等購自寶生物工程(大連)有限公司；RNA提取、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自上海華舜生物技術(shù)有限公司；StepOne Software v2.0實時熒光定量PCR儀為美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品。

1.3 RF-PCR方法的建立

1.3.1引物和探針設(shè)計根據(jù)本實驗室分離病毒株以及GenBank登錄的甲型H1N1流感病毒HA基因核苷酸序列(JF915184.1)，采用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析，選出高度保守并且特異的核苷酸區(qū)域，用 Primer Ex-press 2.0軟件設(shè)計引物：F Primer：5'-AAATCTAGTGGTACCGAGATATGCA-3'和 R Primer： 5'-GGGAGGCTGGTGTTTATAGCAC-3'， 擴(kuò)增片段大小為173bp；探針：MGB Taq Man：5'-CA ATGGAAAGAAATGCTGG-3'。

1.3.2RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄按照試劑操作說明提取病毒RNA。以其為模板，利用流感病毒通用反轉(zhuǎn)錄引物uni12(序列為：5'-AGCAAAAGCAGG-3')進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：70℃10min，37℃90m in。

1.3.3Real-time PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化以稀釋的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒為模板，以獲得最小Ct值及最高熒光值為指標(biāo)，采用矩陣法對引物濃度(0.1μM～0.9μM)及探針濃度(0.09μM～0.25μM)進(jìn)行優(yōu)化。同時在Taq Man熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件中，選擇最佳退火溫度(55℃～65℃)對相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測。

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與結(jié)果判定將pMD-HA重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋至1.92×109copies/μL～19.2copies/μL，在最佳反應(yīng)條件下同時擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。熒光強度增加值為陰性對照的2倍～3倍及循環(huán)閾值≤0判定為陽性，反之判定為陰性。

1.3.5特異性試驗分別選擇古典型豬H1N1、類禽型 H1N1、類人 H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2不同譜系豬流感病毒 cDNA，以及PRV、PRRSV核酸為模板進(jìn)行RF-PCR擴(kuò)增，檢測該方法的特異性。

1.3.6敏感性試驗以PBS將108TCID50/m L病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-1TCID50/m L，分別提取RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行靈敏度檢測。

1.3.7重復(fù)性試驗將同一樣品在相同條件下進(jìn)行5次組內(nèi)和組間重復(fù)試驗，測定該方法的重復(fù)性。

1.3.8臨床樣本檢測將含量為107TCID50/m L甲型H1N1流感病毒2m L，滴鼻接種40日齡仔豬3頭；對照組2頭接種等體積生理鹽水。感染后每天采集豬鼻拭子樣品，置于1m L DMEM中；同時于感染后第3d、第5d和第7d各迫殺一頭豬，采集其肺臟和肺臟灌洗液樣品，于-80℃凍存，用于病毒檢測。對廣東、廣西、江蘇、黑龍江省等豬場分離的疑似甲型H1N1樣品44份進(jìn)行Taq Man熒光定量PCR檢測，與最終病毒測序鑒定結(jié)果比較，檢驗該方法的臨床檢測效果。

2 結(jié) 果

2.1 反應(yīng)體系的優(yōu)化 對引物和探針的濃度、退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，最佳RT-PCR反應(yīng)體系為：模板2μL，F(xiàn)/R(10pmol/μL)各 1.8μL、Taq Man 探針(5pmol/μL)1μL、2×Premix Ex Taq 10μL、dH2O 3μL、ROX Reference Dye(50×)0.4μL。RT-PCR 反應(yīng)條件：95℃15s，55℃ 30s、72℃30s，40個循環(huán)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以10倍梯度稀釋的陽性重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增，得到相應(yīng)的動力學(xué)曲線，其濃度 1.92×109copies/μL～19.2copies/μL 檢測的 R2值達(dá)到0.999，擴(kuò)增效率達(dá)到104.27%，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為 y=-3.224x+39.715(圖 1)。測到50TCID50的病毒(圖3)。

2.3 RF-PCR特異性試驗 分別選擇重組質(zhì)粒、甲型H1N1流感病毒cDNA為模板，擴(kuò)增結(jié)果為陽性，而古典型豬 H1N1、類禽型 H1N1、類人型H1N1、 H1N2、 H3N2、 H5N1、 H9N2和 以 PRV、PRRSV核酸為模板擴(kuò)增結(jié)果為陰性，表明該方法具有較好的特異性(圖2)。

2.4 RF-PCR敏感性試驗 將108TCID50病毒進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-1TCID50，分別提取RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，進(jìn)行敏感性試驗，結(jié)果顯示最低可以檢

2.5 RF-PCR重復(fù)性試驗 重復(fù)擴(kuò)增試驗Ct值變異系數(shù)小于3.12%，表明RF-PCR檢測方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性高(表1)。

2.6 人工感染及臨床樣品檢測試驗 分別于人工感染后1d～7d采集實驗豬鼻拭子樣品，在3d、5d、7d迫殺取肺臟和肺灌洗液進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，第3d樣品中病毒感染量最高，其結(jié)果與TCID50檢測結(jié)果一致(圖4)。RF-PCR檢測臨床樣品結(jié)果表明：44份樣品中17份鑒定為甲型H1N1陽性樣品均出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，并且與實驗室最終測序鑒定結(jié)果相符。

表1 實時熒光定量PCR的組內(nèi)、組間重復(fù)性實驗結(jié)果(n=5)Table 1Intra-assay and Inter-assay reproducibility test of real-time PCR(n=5)

3 討 論

甲型H1N1流感病毒造成世界范圍的人際傳播之后，很快就傳播到豬群中。研究表明甲型H1N1流感病毒傳染性很強，極易發(fā)生基因重排。我國是世界上最大的養(yǎng)豬國家，SIV流行亞型眾多，為甲型H1N1流感病毒和其他亞型病毒株進(jìn)行重組提供了有利條件。由于豬和人的種間屏障相對較低，重組病毒株極易由豬傳給人，威脅人類的生命安全。流行病學(xué)研究表明，我國豬群中甲型H1N1流感病毒的分離鑒定已經(jīng)有相關(guān)的報道。甲型H1N1流感病毒傳播能力很強，因此早期的快速診斷對于疫情的控制至關(guān)重要。本研究建立并優(yōu)化了Real-time PCR檢測方法，為甲型H1N1類SIV檢測和監(jiān)測提供快速、靈敏、特異的方法。

甲型H1N1流感病毒的HA基因來源于北美三源重組H1N2流感病毒，二者同源性可達(dá)95%以上，這為鑒別診斷方法的建立增加了難度。經(jīng)過反復(fù)序列比較后，在有限的保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針，利用Taq Man MGB探針增加溶解溫度(Tm)，以此為基礎(chǔ)建立的方法能夠有效地將甲型H1N1流感病毒的HA基因與其他譜系H1N1SIV區(qū)分開。采用正交試驗方法對試驗體系進(jìn)行了優(yōu)化，確定檢測敏感度可達(dá)到50TCID50。特異性表明，建立的方法可以完全針對我國豬群中流行的主要亞型進(jìn)行甲型H1N1類流感病毒的鑒別檢測。

在44份可疑樣品中，有17份結(jié)果為RF-PCR試驗陽性，與病毒分離和最后測序結(jié)果確定甲型H1N1流感病毒陽性樣品有高達(dá)100%的符合率，但敏感性試驗表明檢測敏感度可達(dá)到50TCID50，這表明該方法不能完全代替病毒分離鑒定方法來做出疾病的最終診斷，但相對于病毒分離鑒定需要1～2個星期，RF-PCR具有快速的特點，僅需要幾個小時就能完成，為疾病或疫情的早期診斷提供了重要的檢測方法，并且該方法具有快速、簡單、識別病毒全基因序列和特點，能夠幫助我們更好地了解病毒的重組和病毒生長動力學(xué)，在對疾病和疫情的診斷中，RF-PCR和病毒分離鑒定可以互為補充，以達(dá)到快速，準(zhǔn)確檢測的目的。

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