MMP－1及MMP－3在心肌肥厚大鼠中的表達及奧美沙坦對其影響

李 涵 趙玉蘭 張 強 (鄭州大學第二附屬醫(yī)院心血管內科，河南 鄭州 450014)

心肌肥厚是多種心血管疾病的共同病理過程，其發(fā)生的結構基礎主要是心肌細胞增大和纖維化。其過程包括了心肌細胞肥大和間質成分改變，亦可稱為心肌重構。心肌重構最終導致冠脈血流儲備減少，增加心肌缺血，從而導致心衰、心律失常、猝死等。目前多項研究表明，細胞外基質(ECM)尤其是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維的異常改變，在心肌重構中起重要作用。細胞外基質(ECM)的改建，尤其是心肌膠原的沉積與心肌細胞肥大不同步發(fā)展是促使心肌肥厚由代償向失代償轉變的主要原因之一〔1〕。多項研究已經證明心肌重構的產生與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)有關。奧美沙坦作為ARB類藥物可完全阻斷血管緊張素Ⅱ與其受體的結合，從而抑制心肌重構。本實驗建立心肌肥厚大鼠模型，觀察大鼠心肌中MMP-1、MMP-3的表達水平，并用奧美沙坦進行干預，為奧美沙坦改善心肌重構提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由鄭州大學實驗動物中心提供雄性Wistar大鼠300～350 g 30只，隨機分為對照組(甲組)、模型組(乙組)、干預組(丙組)，每組10只，三組間重量無統(tǒng)計學意義。

1.2 心肌肥厚模型制備 (1)三組均于大鼠背部皮下注射，甲組按3 ml·kg－1·d-1注射生理鹽水，每天 2次，連續(xù) 10 d。乙組、丙組按3 mg·kg－1·d－1注射異丙腎上腺素，每天2次，連續(xù) 10 d，同時甲、乙組生理鹽水灌胃 1 ml/d，丙組按10 mg·kg－1·d－1奧美沙坦灌胃一次，連續(xù) 10 d。(2)三組大鼠10 d用藥后稱其重量，再將各組用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，開胸取心臟，稱取全心濕重及左心室濕重。左心室一部分心肌標本保存在液氮中，用于提取RNA進行實時PCR，另一部分置于100 g/L多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋切片(5 μm)。

1.3 HE染色 將取出的心臟標本置4%多聚甲醛固定24 h(4℃)，常規(guī)石蠟包埋，沿左室長線每隔1 mm橫斷面切取數張5 μm 厚，HE 染色。

1.4 心肌肥厚組織MMP-1、MMP-3 mRNA的測定 實時熒光定量PCR測定肥厚心肌MMP-1 mRNA的相對表達。①總RNA的提取。將在液氮中凍存的樣品取出后剪碎，使用TRIzol試劑盒提取總RNA(步驟詳見說明書)。②cDNA的合成。1 μl總RNA通過隨機引物M-MLV以15 μl體系逆轉錄生成所需cDNA。③實時 PCR。MMP-1 的參數為94℃3 min，94℃ 30 s，72℃1 min，72℃5 min，40個循環(huán)。依據擴增長度配制1.5%瓊脂糖凝膠(50 ml)，微波爐加熱前加入核酸凝膠染色劑GelRed 5 μl(即稀釋至1∶10 000)，冷卻后制膠，取 5 μl PCR 產物加1.0 μl上樣緩沖液(0.25%溴芬藍，40%蔗糖)，穩(wěn)壓電泳80 V約40 min。凝膠在UVP凝膠成像系統(tǒng)中掃描觀察結果、拍照，采用圖像分析軟件BandScan5.0分析電泳條帶的光密度值，計算MMP-1內參的光密度積分值比值作為MMP-1的相對表達量。MMP-3測定參照MMP-1。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS17.0軟件處理數據，計算資料以表示，組間資料采用單因素方差分析及LSD檢驗。

2 結果

2.1 三組大鼠體重，心臟重量，左室重量，左室重量指數比較

見表1。三組實驗大鼠體重差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，乙組、丙組的左室重量、心臟重量、左室重量指數都高于甲組(P＜0.05)，丙組左室重量、心臟重量、左室重量指數均低于乙組(P＜0.05)。

表1 各組大鼠左室重量、心臟重量、左室重量指數和體重的比較(，n=10)

表1 各組大鼠左室重量、心臟重量、左室重量指數和體重的比較(，n=10)

與甲組比較:1)P＜0.05;與乙組比較:2)P＜0.05;下表同

組別 左室重量(mg)心臟重量(mg)左室重量指數(mg/g)10 d后體重(g)甲組 614.44±4.92 753.89±9.31 1.78±0.01 344.97±5 344.48±1.63.46乙組 867.25±3.911) 970.05±5.541) 2.47±0.021) 350.83±2.91丙組760.83±4.251)2)874.56±6.611)2)2.20±0.011)2)

2.2 三組大鼠心肌組織病理改變 對照組小鼠心肌細胞排列整齊，模型組和干預組與對照組相比心肌細胞均有肥大現象，心肌間隙增寬，且模型組較干預組更為明顯。

對照組心肌細胞結構正常，排列整齊;模型組細胞明顯肥大且排列不規(guī)則，心肌組織中纖維結締組織增生;干預組大鼠的心肌細胞亦有病理損傷，但損傷程度較模型組輕。見圖1。

2.3 三組大鼠心肌MMP-1、MMP-3 mRNA表達的比較 見表2，圖2。乙組、丙組MMP-1、MMP-3 mRNA表達高于甲組(P＜0.05)，乙組高于丙組(P＜0.05)。

表2 各組大鼠心肌細胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(，n=10)

表2 各組大鼠心肌細胞MMP-1、MMP-3 mRNA的表達(，n=10)

組別MMP-1 MMP-3甲組0.107±0.009 0.084±0.007乙組 0.626±0.037 0.405±0.024丙組0.313±0.018 0.196±0.013

圖1 三組大鼠心肌組織病理改變(HE，×100)

圖2 三組大鼠MMP-1、MMP-3 mRNA表達

3 討論

心肌肥厚是心臟對慢性壓力或容量超負荷產生的靶器官反應，是一種極其重要的、獨立的心血管危險因素，可使心肌缺血、心律失常、心力衰竭和猝死的幾率增加6～10倍。本實驗用異丙腎上腺素建立大鼠心肌肥厚模型〔2〕，建模10 d后通過病理學觀察，模型組和干預組心肌細胞明顯肥大，左室重量及左室重量指數均明顯高于對照組。

ECM圍繞在心肌細胞周圍，可保護心臟功能及結構的完整性。心肌肥厚的過程主要包括心肌細胞的肥大和間質的纖維化，初期的心肌肥厚有一定的代償意義，但隨著心肌間質成纖維細胞的增殖，細胞外基質只要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維沉積異常增加，是心肌結構的功能發(fā)生重塑，最終導致冠脈血流儲備減少，增加心肌缺血，從而引起心力衰竭、心律失常、猝死等。MMPs是水解ECM的蛋白裂解酶，主要由膠原構成。MMPs的表達和活性增強，可導致正常心肌膠原蛋白過度降解，并被缺乏連接結構的纖維間質取代，使心臟組織重構，最終導致心功能惡化。MMP-1可降解變性的膠原，MMP-3可作用于Ⅲ型、Ⅳ型膠原及明膠。MMP-1和MMP-3的表達水平可間接反映心肌肥厚程度。

心肌重構過程中，RAAS發(fā)揮著很重要的作用，血管緊張素Ⅱ是RAAS中最重要的效應因子，可作用于間質細胞和心肌細胞啟動重構。血管緊張素受體包含兩種不同的亞型，AT1和AT2，AngⅡ作用于心肌細胞的AT1受體，使心肌細胞蛋白合成增加、心肌肥大，與心肌重塑相關基因的表達上調，同時還可促進心肌細胞的凋亡。AngⅡ作用于心臟成纖維細胞的AT1受體，誘導組織纖維化，膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ合成增加，從而刺激MMP-1和MMP-3的表達和活性增強，導致正常心肌膠原蛋白過度降解，心臟組織重構。ARB是AT1受體的無活性配體，可以與AngⅡ競爭AT1的結合位點〔3〕。因此，ARB藥物的作用都是阻斷RAAS，減少AngⅡ并抑制其與配體的結合，從而達到抑制心肌重塑的目的。本試驗使用ARB類藥物奧美沙坦對心肌肥厚大鼠進行干預，結果顯示干預組的左室重量、心臟重量、左室重量指數均低于模型組，為奧美沙坦抗心肌肥厚機制提供了理論依據。

1 Berenji K，Drazner MH Rothermel BA，et al.Does load-induced ventricular hypertrophy progress to systolic heart failure〔J〕?Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005;289(1):H8-H16.

2 White P，Brestelli JE，Kaestner KH，et al.Identification of transcription networks during liver regeneration〔J〕.J Biol Chem，2005;280(5):3715-22.

3 馬曉慶，蘇勝偶.內皮素、血管緊張素Ⅱ、轉化生長因子p1與心肌肥厚關系的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2009;9(6);767-8.