蘆竹內(nèi)源性寡糖素抑制藍(lán)藻活性的作用

郭靜雯，張忠山，王曉梅，韓志萍，張易祥

(1.湖州師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，浙江湖州 313000;2.福建省化學(xué)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門 361000)

近年來，人們?yōu)榱酥卫砀粻I(yíng)養(yǎng)化水域，利用高等水生植物與藻類的相互作用現(xiàn)象達(dá)到目的。目前已有較多植物的抑藻成分得到提取和鑒定，并在水域生態(tài)保護(hù)上起到重要作用［1－3］。本文報(bào)道了蘆竹提取物對(duì)藍(lán)藻 (藍(lán)藻)的抑制作用，并從中提取分離出抑藻活性物質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘆竹采于浙江省湖州師范學(xué)院德清湖岸，清洗干凈，烘干備用。銅綠微囊藻由生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞研究所獲得，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng)后用于試驗(yàn)。

試劑乙醇、苯酚、葡萄糖等，除特殊說明外，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆竹組織提取液的制備

稱取100 g干蘆竹植株 (粉碎至0.3 mm)，置于三口燒瓶中，加入10倍蒸餾水于80℃提取3 h，提取液濃縮至100～200 mL，加入4倍體積無水乙醇。過濾，將上清液濃縮凍干，同時(shí)收集沉淀。分別記錄醇溶物和水溶物，并各溶于水配制成10%濃度備用。

1.2.2 總糖含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖50 mg于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻。分別吸取0.05，0.10，0.15，0.20，0.25和0.30 mL各補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，然后加入1 mL 5%苯酚后快速加入濃硫酸5.0 mL。迅速搖勻，室溫靜置30 min后，于490 nm處測(cè)吸光度D。以2.0 mL蒸餾水作為空白組按照上述同樣操作步驟進(jìn)行。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)來繪制標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線。

分別取樣品溶液適量補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟測(cè)定各濃度下的吸光度，并計(jì)算樣品中的總糖含量。

1.2.3 樣品分子量的測(cè)定

樣品分子量測(cè)定采用高效液相色譜法進(jìn)行，色譜柱為TSK G3000(300 mm×7.8 mm)，柱溫為40℃。將樣品配成2%的硫酸鈉溶液上樣分析，2.84%的硫酸鈉溶液洗脫，流速為0.5 mL·min－1，示差檢測(cè)器檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)多糖采用一系列的不同分子量的右旋多糖酐，其分子量為2 500～2 000 000 u。

1.2.4 樣品抑藻活性試驗(yàn)

將樣品分別配成濃度為0.01%，0.05%，0.50%和5.00%的水溶液，加入到裝有BG-11培養(yǎng)基 (預(yù)先高溫高壓滅菌)的培養(yǎng)瓶中，每瓶接種入3 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的銅綠微囊藻細(xì)胞懸液。以蒸餾水為對(duì)照，每處理設(shè)2個(gè)重復(fù)。接種后置專用培養(yǎng)架上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為2 000 lx，光暗周期比為12 h∶12 h。

1.2.5 藍(lán)藻生長(zhǎng)量的測(cè)定

分別于接種后第0～19天，在665和649 nm兩個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)定藍(lán)藻吸光度 (D665和D649)，以D665的變化表示藍(lán)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。

1.2.6 葉綠素a的測(cè)定

葉綠素a的含量用比色法測(cè)定。色素的濃度=13.95D665－6.88D649。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用WPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取液

將蘆竹葉提取液加入乙醇后，出現(xiàn)大量白色沉淀。上清液回收乙醇后冷凍干燥呈黃色，在空氣中暴露后迅速吸水呈現(xiàn)油狀，加水迅速溶解。兩者分別記錄為醇溶物和水溶物，但是均在水中可溶。

2.2 樣品總糖含量

采用苯酚－硫酸法測(cè)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)濃度0.002～0.010 mg·mL－1時(shí)線性關(guān)系最好。線性回歸方程為y=49.624x－0.004 6(R2=0.999 9)。在試驗(yàn)條件下探索得取350 μL樣品溶液補(bǔ)蒸餾水至2.0 mL，分別測(cè)出的蘆竹葉上清液提取物和沉淀提取物的吸光度為最適吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蘆竹葉醇溶物和水溶物中總糖含量分別為0.14%和54.30%。

2.3 樣品分子量

經(jīng)過高效凝膠色譜測(cè)定，醇溶物和水溶物的重均分子量分別為547和3 359 u。結(jié)合總糖含量測(cè)定結(jié)果，可得出水溶物應(yīng)為寡糖素類化合物。

2.4 蘆竹葉上清液提取物對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響

圖1表明，0.01%和0.05%的蘆竹葉上清液提取物對(duì)藍(lán)藻有一定的促進(jìn)作用，且促進(jìn)作用呈顯著增大的趨勢(shì)。5.00%的蘆竹葉上清液提取物則起穩(wěn)定的抑制作用。而0.50%的蘆竹葉上清液提取物對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響是復(fù)雜的。接種第0～15天有明顯的促進(jìn)作用，從第16天開始又顯示抑制作用，且抑制的程度大小也有波動(dòng)。

2.5 蘆竹葉沉淀提取物對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響

觀察圖2可知，0.01%和0.05%的蘆竹葉沉淀提取物對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，且兩者的促進(jìn)程度相類似。在接種的第6～11天，0.50%的蘆竹葉沉淀提取物有小范圍的波動(dòng)，但大體上呈抑制作用。5.00%的蘆竹葉沉淀提取物則從第4天開始呈平穩(wěn)的抑制作用。

圖1 不同濃度上清液提取物吸光度隨時(shí)間的變化

圖2 不同濃度沉淀提取物的吸光度隨時(shí)間的變化

由圖3看出，葉綠素含量隨天數(shù)有明顯的變化，即反映的是接種藍(lán)藻的生長(zhǎng)情況。與圖1對(duì)比，曲線呈類似的變化趨勢(shì)，可推斷藍(lán)藻出現(xiàn)不同的生長(zhǎng)情況是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)基內(nèi)加了蘆竹葉上清液提取物的緣故。而不同濃度上清液提取物對(duì)藍(lán)藻生長(zhǎng)的影響是不同的，基本符合高濃度抑制和低濃度促進(jìn)的規(guī)律。對(duì)比圖2，4曲線，也能得到上述結(jié)論。

圖3 上清液提取物的葉綠素含量隨時(shí)間的變化

圖4 沉淀提取物的葉綠素含量隨時(shí)間的變化

3 小結(jié)和討論

近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者大多數(shù)利用植物種植水［2，4］和植物提取物［5－7］進(jìn)行藻類的化感作用研究。本研究表明，蘆竹植物器官組織不同物質(zhì)具有不同的抑藻效果。試驗(yàn)表明，蘆竹的水提取物中含有糖類物質(zhì)，初步推測(cè)為纖維寡糖，具有一定抑藻活性，其結(jié)構(gòu)有待于深入研究。蘆竹在江浙地區(qū)的水體岸邊具有較廣泛的分布，在富營(yíng)養(yǎng)化水體中種植挺水植物蘆竹，不僅可吸收利用富營(yíng)養(yǎng)化水體中的氮和磷，以及蘆竹釋放的抑藻化感物質(zhì)，還可直接抑制藍(lán)藻的生長(zhǎng)。因此，本研究可為探索切實(shí)可行的富營(yíng)養(yǎng)化水體的生態(tài)治理提供科學(xué)依據(jù)。

［1］陳建中，李利芳，張海洋，等．蘆竹和睡蓮對(duì)銅綠微囊藻的生長(zhǎng)抑制效應(yīng) ［J］．環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2011，34(7):35－37.

［2］李磊，侯文華．荷花和睡蓮種植水對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的抑制作用研究［J］．環(huán)境科學(xué)，2007，28(10):2180－2186.

［3］戴樹桂，趙凡，金朝暉，等．香蒲植物提取物的抑藻作用及其分離鑒定［J］．環(huán)境化學(xué)，1997，16(3):268－271.

［4］陳衛(wèi)民，張清敏，戴樹桂．苦草與銅綠微囊藻的相互化感作用 ［J］．中國(guó)環(huán)境科學(xué)，2009，29(2):147－151.

［5］丁惠君，彭祺，張維昊，等．三種濕生植物對(duì)微囊藻的化感作用初步分析 ［J］．環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2007，30(4):6－10.

［6］馮菁，朱擎，吳為中，等．稻草浸泡液對(duì)藻類抑制作用機(jī)制 ［J］．環(huán)境科學(xué)，2008，29(12):3376－3381.

［7］洪喻，胡洪營(yíng)，黃晶晶，等．不同溶劑提取蘆竹化感物質(zhì)對(duì)銅綠微囊藻生長(zhǎng)的影響 ［J］．環(huán)境科學(xué)，2008，29(11):3143－3147.