復(fù)方中草藥對慢性氟中毒大鼠血清、尿HYP 含量的影響

邰春格 內(nèi)蒙古包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 014035

氟是原子序數(shù)為9 的非金屬元素，其電負(fù)性最大，化學(xué)性質(zhì)極其活潑，能與除惰性氣體外的所有元素發(fā)生反應(yīng)。因此，自然界無單質(zhì)氟，以氟化物形式廣泛存在。人體內(nèi)幾乎所有的器官都含有氟,其中骨骼、牙齒中含量最高，占人體總氟量的90%以上，軟組織中含氟最多的是皮膚。氟的化合物特別是離子型化合物很容易被生物體吸收，它的吸收率僅次于水和氟化物。研究表明，消化道對飲水中的氟可吸收95%以上，對食物中的氟可吸收80%左右，對骨粉中的氟則較難吸收，吸收率為37%～50%。消化道氟的吸收部位主要在胃和小腸，氟幾乎是唯一能在胃中吸收的元素。氟不但吸收率高，而且吸收速度快。氟的吸收受很多因素影響，如氟化物的溶解度，飲食中的鈣、鎂、鋁、蛋白質(zhì)和維生素C 的含量等。氟離子本身不能通過細(xì)胞膜，由于細(xì)胞內(nèi)存在pH 梯度，氟的跨膜運(yùn)輸是以HF 形式被動擴(kuò)散的。在胃液pH 為1 的條件下，胃中的氟有99%以HF 形式存在，這是氟在胃中易于吸收的重要條件。腎臟是氟的主要排泄器官，每天攝入的氟有50%以上經(jīng)腎由尿液排出，只有一小部分經(jīng)糞便、汗液和呼吸等排出。氟是人和動物的必需微量元素，適量的氟能促進(jìn)動物的生長、發(fā)育和繁殖，參與骨骼代謝和預(yù)防齲齒，影響動物造血功能及神經(jīng)內(nèi)興奮性和傳導(dǎo)的作用。氟屬于中等中毒元素，其肌肉注射量為0.01～0.1g/kg 體重，半數(shù)致死量經(jīng)口攝入為0.141g/kg 體重，氟化物在血漿中的半衰期為4～10d。

氟中毒包括有機(jī)氟中毒和無機(jī)氟中毒。有機(jī)氟中毒主要由藥效強(qiáng)、殘效期長的農(nóng)藥或殺鼠藥引起的。無機(jī)氟中毒是氟中毒中最常見的，它又分為急性氟中毒和慢性氟中毒。急性氟中毒是食入過量氟化物后短時間內(nèi)引起惡心、嘔吐、胃腸炎、腹瀉、呼吸困難、肌肉震顫、虛脫等癥狀的疾病，只偶爾發(fā)生。而慢性氟中毒是世界范圍內(nèi)分布廣泛的一種人畜共患病。該病是由于長期連續(xù)攝入超過安全劑量的無機(jī)氟化物而引起的以牙齒、骨骼損害為主的全身性疾病。慢性氟中毒又包括地方性氟中毒和工業(yè)性氟中毒。地方性氟中毒主要發(fā)生在自然高氟區(qū)，該區(qū)地殼局部隱藏的巖石種類及土壤種類不同，土壤和水源中含氟量較高。工業(yè)性氟中毒與工業(yè)排放的含氟廢氣直接相關(guān)，凡利用含氟的礦石作原料的工廠，如陶瓷廠、鋼鐵廠、磚瓦廠、化肥廠等，如未采取有效的除氟措施，隨“三廢”排出的氟化物污染周圍大氣、植物、土壤、地表水導(dǎo)致人畜發(fā)病。

工業(yè)廢氣中的氟主要為HF 和SF4，均有很強(qiáng)的毒性，并能被植物葉片吸收。而且葉片可以粘附含氟降塵，故在工業(yè)氟污染區(qū)，動物長期食入高氟牧草后會引起氟中毒。隨著大型工業(yè)的發(fā)展，世界很多地區(qū)工業(yè)氟污染已成為嚴(yán)重的公害。一般認(rèn)為，哺乳期新生幼畜不發(fā)病，生長期牲畜在永久齒形成和更換時期氟危害最嚴(yán)重，損害后不僅形成氟斑牙，而且牙齒的硬度降低、易受損，形成長短牙或波狀牙，影響咀嚼，最后導(dǎo)致營養(yǎng)衰竭。成年家畜主要發(fā)生氟骨癥。另外，不同家畜受氟損害程度不同，其中奶牛對氟最敏感。

氟在骨骼中的儲藏是被組合進(jìn)入羥基磷灰石的晶體中，但氟不能代替骨中的磷酸根。不過骨的氟化可使其中的磷酸鹽降低，即氟可置換骨中的碳酸根，而有利于骨骼組織的成熟，提高骨骼硬度。氟對牙齒的形成也有類似的作用。氟磷灰石結(jié)晶能取代牙齒形成期間一些羥基磷灰石結(jié)晶，同時氟還可以使碳水化合物產(chǎn)生的酸性細(xì)菌酶類失去活性，能保持牙齒健康及抑制牙齒表面酶類細(xì)菌的代謝過程。

氟在動物軟組織中的濃度正常情況下較低，除骨骼和牙齒外，都不具有濃縮氟的作用。正常成年放牧動物，全部脫脂干骨里氟的濃度是0.3～0.6g/kg，牙齒氟的濃度在0.2～0.55g/kg，占畜體內(nèi)氟的95%以上。

膠原是骨和結(jié)蹄組織的主要成分，它同組織纖維化以及骨或其他組織鈣化有密切關(guān)系。它的代謝差產(chǎn)物是羥脯氨酸，后者隨尿排出。尿羥脯氨酸排泄數(shù)來源于骨膠原，其排泄量多少可作為反映膠原總轉(zhuǎn)換率的有力指標(biāo)。羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分，不屬于20 種常見的氨基酸。這些年來，羥脯氨酸的研究與開發(fā)已經(jīng)引起醫(yī)藥、生化、食品及美容業(yè)等方面的廣泛關(guān)注。它具有抗氧化和抗輻射作用，具有多種生理功能與獨(dú)特的生物活性，可作為治療軟組織疾病的藥物，如結(jié)蹄組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，它對急慢性肝病導(dǎo)致的低蛋白血癥有一定療效，它參與脂肪的乳化及紅細(xì)胞血紅素和球蛋白的形成。體內(nèi)羥脯氨酸平衡失調(diào)會引起疾病。脯氨酸羥化酶和羥脯氨酸脫氫酶是體內(nèi)羥脯氨酸代謝的兩個關(guān)鍵酶。催化成分的羥脯氨酸羥化酶位于組織的微粒體中，并且需要很多輔助因子催化。在體內(nèi)未降解的羥脯氨酸常與寡肽結(jié)合后從腎臟清除，為尿中羥脯氨酸的主要形式。當(dāng)羥脯氨酸脫氫酶缺乏時，雖然尿中寡肽結(jié)合羥脯氨酸比正常高出十幾倍。發(fā)生纖維化病變組織中的羥脯氨酸含量也會比正常高出很多，因此體液羥脯氨酸平衡失調(diào)涉及到許多疾病，列如造成牙齒、骨骼中的軟骨和韌帶組織減弱以及組織纖維化疾病等。膠原蛋白大多分布在皮膚、腱、軟骨和血管等處，在身體的各個部分擔(dān)任著非常重要的角色，而羥脯氨酸是合成膠原的重要氨基酸，其含量多少決定膠原蛋白的數(shù)量，也可反映組織代謝狀況。

本實(shí)驗(yàn)在借鑒中醫(yī)理論和慢性氟中毒機(jī)理的基礎(chǔ)上，結(jié)合內(nèi)蒙古地區(qū)豐富的中草藥資源，在經(jīng)驗(yàn)配方的基礎(chǔ)上篩選出抗氟復(fù)方中草藥，用wisar大鼠復(fù)制慢性氟中毒模型，并跟蹤監(jiān)測尿和血清的尿羥脯氨酸含量，以探討抗氟復(fù)方中草藥對慢性氟中毒前期的大鼠的拮抗作用及作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

（1）實(shí)驗(yàn)動物及分組

清潔級wisar 大鼠雌雄各半，由內(nèi)蒙古實(shí)驗(yàn)動物中心提供，初始體重為90～110g，共66 只隨機(jī)分成7 組：

第一組為陰性對照組，8 只，自由飲用自來水；第二組為陽性對照組，自由飲用氟濃度為100ug/ml的自來水；第3～7 組為中毒組，飲用含氟100ug/ml的自來水，并用A、B、C、D、E 五種不同的復(fù)方中草藥治療，按0.1g/kg 體重的劑量經(jīng)口灌服。

全部大鼠飼料為由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供的固體顆粒飼料。

（2）實(shí)驗(yàn)儀器

78-1 型磁力攪拌器，杭州儀表電機(jī)廠；電子天平，上海精密儀器有限公司；離心機(jī)，上?？茖W(xué)儀器公司。

（3）試劑

羥脯氨酸測試盒，南京建成生物工程研究所，20060322。

復(fù)方中草藥由當(dāng)歸、桃仁、紅花、乳香、黃氏等10 味藥組方，由內(nèi)蒙古萬民大藥房提供。氟化鈉，天津化學(xué)試劑三廠，分析純。

（4）數(shù)據(jù)處理

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s 表示，顯著性檢驗(yàn)，用SAS8.1 軟件進(jìn)行方差分析；ExceL 軟件進(jìn)行線性回歸分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）血清中羥脯氨酸測定

表1 血清中羥脯氨酸測定程序操作表

混勻，60℃水浴15分鐘，冷卻后在550nm 處，1cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度。

（2）尿液中羥脯氨酸測定

表2 尿中羥脯氨酸測定程序操作表

混勻，60℃水浴15分鐘，冷卻后在550nm 處，1cm 光徑，蒸餾水調(diào)零，測各管吸光度。

(3) 計算

大鼠血清和尿中羥脯氨酸含量用下列公式計算：

羥脯氨酸含量=（測定管吸光度-空白管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)管含量×（水解液總體積/取樣量）

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)各組大鼠血清羥脯氨酸含量測定結(jié)果見表3 和圖1。實(shí)驗(yàn)各組大鼠羥脯氨酸含量測定結(jié)果見表4 和圖2。

圖1 血清中羥脯氨酸含量曲線圖

表3 大鼠血清中羥脯氨酸含量（g/L）

由表3 和圖1 可知，在氟中毒的不同時期，各組大鼠的血清HYP 含量是隨時間的延長而增加。第一個月，第六、第七組大鼠血清HYP 含量顯著低于一、二組；第二個月，第四、六、七組大鼠的血清HYP 含量顯著高于第一組；第三個月，各組大鼠血清的HYP 含量均無顯著差異。

圖2 尿中羥脯氨酸含量曲線圖

表4 各組大鼠尿液羥脯氨酸含量 單位（g/L）

由表4 和圖2 可知，在氟中毒的不同時期，各組的尿HYP 含量隨著時間的延長而增加。第二周，第四組顯著高于第一、二組；第三、六組顯著低于第一、二組。第四周，第三、四、五、六、七組都顯著低于第一組，第七、六、五、四組顯著低于第二組。第六周，第五組顯著高于一、二組，第六組顯著低于第二組。第八周，第五組顯著高于第一、二組，第四、六組顯著低于一、二組。第十周，第二組顯著高于第一組；第五、七組顯著低于第一組；第五、七組極顯著低于第二組。第十二周，第七組顯著低于第一組。

3 討論

3.1 慢性氟中毒模型的建立

動物慢性氟中毒最為顯著的特征是氟斑牙。因此，經(jīng)常將氟斑牙作為判斷慢性氟中毒模型建立成功與否的可靠指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)在給大鼠飲用含氟的自來水3 個月時，大鼠均出現(xiàn)明顯的氟斑牙，說明已成功復(fù)制出慢性氟中毒模型。

3.2 復(fù)方中草藥對慢性氟中毒大鼠血清和尿中羥脯氨酸含量的影響

氟化物對動物非骨相損害的研究是近年來氟研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。上世紀(jì)80 年代，在印度學(xué)者提出“膠原蛋白質(zhì)是氟化物作用的主要靶子”學(xué)說的基礎(chǔ)上，科研工作者們開展了氟對機(jī)體膠原蛋白質(zhì)代謝影響的廣泛研究。有資料報道，氟對膠原蛋白質(zhì)的合成代謝和分解代謝有著重要影響。氟可抑制膠原蛋白的生物合成，同時又能夠促進(jìn)膠原蛋白的分解。羥脯氨酸是膠原蛋白代謝的重要產(chǎn)物，氟中毒時必然直接或間接地影響羥脯氨酸的代謝，使血和尿中羥脯氨酸含量發(fā)生變化。

本實(shí)驗(yàn)中各組大鼠的血清羥脯氨酸含量都是隨著時間的延長而增加。尿液中羥脯氨酸含量除第十周正常組大鼠低于中毒組外，其他各時間點(diǎn)兩者的差異均不顯著。這一結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報道不相一致，其原因有待于進(jìn)一步研究探討。

經(jīng)復(fù)方中草藥D 方治療的氟中毒大鼠的血清和尿羥脯氨酸含量均顯著低于正常鼠和氟中毒鼠，表明此方對膠原蛋白質(zhì)的合成和分解代謝有一定影響。

4 結(jié)論

大鼠慢性氟中毒時，血清和尿中羥脯氨酸含量和正常鼠基本一致。

D 方能夠降低慢性氟中毒大鼠血清和尿中羥脯氨酸的含量。

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